金钗石斛生物碱的提取技术及临床前药理作用研究进展

张成宸 袁仁锋

1.遵义医科大学药学院，基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563000；2.瓮安袁庆礼中医医院，贵州 瓮安 550400

从古至今石斛就是稀有的名贵中药，最早在《山海经》中不叫石斛，而叫林兰、禁生。起初人们发现这种植物大多生长在石头上，形态下粗上细，形似古代的斛，故名为石斛。石斛属(DendrobiumSw.)为兰科草本植物，喜温暖、潮湿，全世界约有一千五百多种，我国有近八十种。石斛属植物的茎是中药石斛的主要来源，《中国药典》记载的药用石斛有金钗石斛、铁皮石斛、霍山石斛和鼓槌石斛等。

金钗石斛(Dendrobiumnobile)因茎两头细中间粗，色泽金黄，形如金钗而得名。金钗石斛性寒、气微、味苦，主要活性成分之一是生物碱，有保护神经、调节血糖和血脂、抗肿瘤等作用[1]。石斛碱是金钗石斛的特征性成分，在金钗石斛生物碱中含量最高，常用于评价金钗石斛药材的品质。铁皮石斛味甘、微寒，富含石斛多糖、萜类和黄酮，但生物碱含量低，用于增强免疫力、调节消化系统和心血管系统等[2-3]。霍山石斛气微、味淡，主要成分为多糖，能够改善急性肝损伤[4]。鼓槌石斛气微、味淡，毛兰素含量高于其他石斛品种[5]。金钗石斛如图1所示(图片摄于贵州省赤水市金钗石斛GAP基地)。

图1 金钗石斛实拍图

目前常用气相色谱法检测金钗石斛生物碱的含量。近年来出现超声辅助离子交换树脂、超声辅助聚离子液体等新工艺制备金钗石斛生物碱，提取率高且节能环保。近五年文献报道金钗石斛生物碱有保护神经、肝脏、心肌，降血糖、抗白内障和抗肿瘤的临床前药理作用。金钗石斛在临床上可用于改善代谢综合征及治疗慢性萎缩性胃炎。为了更好开发和利用金钗石斛，文章综述了金钗石斛生物碱的含量测定、提取技术、化学结构及临床前药理作用、机制和金钗石斛的临床应用。

1金钗石斛生物碱的含量测定、提取技术及化学结构

1.1 含量测定 《中国药典》将气相色谱法作为金钗石斛含量测定的标准方法。石斛碱是金钗石斛的质量标志物，在茎中含量最高，在花和叶中含量次之。遵义赤水地区所产金钗石斛的石斛碱含量高于中国药典标准0.4%。使用气相色谱法测定赤水金钗石斛的石斛碱含量为10.6 mg/g[6]。采用高效液相色谱-质谱联用法测定赤水金钗石斛茎的石斛碱含量高于6.0 mg/g[7]。通过高效液相色谱法测定赤水金钗石斛的石斛碱含量为3.0～4.0 mg/g[8]。

图2 金钗石斛倍半萜类生物碱的结构式及分子式示意图

1.2 提取技术 已有专利报道采用酸性乙醇提取、酸水溶液浸泡提取、超临界流体萃取等工艺制备金钗石斛总生物碱。近年来采用超声辅助离子交换树脂制备金钗石斛生物碱，金钗石斛粉末用70%乙醇超声辅助热回流提取，浸膏用弱阴离子交换琼脂糖凝胶柱脱色除杂，然后用强阳离子交换琼脂糖凝胶柱分离得到金钗石斛总生物碱，液相色谱法检测总生物碱提取率为7%[9]。采用超声辅助聚离子液体制备金钗石斛生物碱，将金钗石斛超微粉碎后，加入乙醇超声提取，以咪唑类阳离子型离子液体单体聚合形成的聚离子液体为固相萃取吸附剂，用30%～50%乙醇洗脱后，收集90%乙醇洗脱液真空冷冻干燥得到金钗石斛总生物碱，气相色谱法检测总生物碱提取率为0.49%[10]。

1.3 化学结构 目前已从金钗石斛中分离鉴定出十多种picrotoxane型倍半萜生物碱化合物。根据生物碱的结构特点分为三类：①倍半萜与吡咯环部分组成四环体系，氮原子上烷基取代或季胺化，如化合物1～7；②具有噁唑啉环，如化合物8～12；③含氮五元杂环开裂，如化合物13[11]。生物碱的结构式及分子式如图2所示。

2 金钗石斛生物碱的临床前药理作用

2.1 药物代谢动力学特征 通过石斛碱与CYP450酶体外共孵育，结合UPLC-HR-ESI-Orbitrap-MS技术，采用底物消除法计算石斛碱在人肝微粒体的半衰期(t1/2)为31.44 min[12]。石斛碱在人肝微粒体中的Ⅰ相代谢产物为mubironine B、石斛胺碱、5-烯-石斛碱等，Ⅱ相代谢产物为N-葡萄糖醛酸石斛碱[13]。小鼠灌胃给予石斛碱(60 mg/kg)，发现石斛碱能透过血脑屏障，在肠和肝脏达到较高药物浓度[14]。

2.2 药效作用及机制 近年来文献主要报道金钗石斛总生物碱的临床前药理作用及机制(详见表1)，关于金钗石斛生物碱化合物的药理作用研究还较少。

2.2.1 保护神经 金钗石斛总生物碱改善链脲佐菌素诱导散发型老年痴呆大鼠的空间学习记忆能力障碍，减轻海马CA3区神经元损伤，激活脑内胰岛素信号通路，抑制Tau蛋白高度磷酸化[15-16]。在谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤模型中，金钗石斛总生物碱可以减轻海马神经元损伤，增加神经元自噬体数量，提高LC3BⅡ/LC3BⅠ比值，促进p62降解[17]。金钗石斛总生物碱抑制Aβ1-42诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡，降低CaMKK2磷酸化，减少Caspase-3蛋白活化[18]。金钗石斛总生物碱减轻Aβ25-35诱导大鼠皮质神经元损伤，增加突触相关PSD-95及SYP表达；改善Aβ25-35诱导大鼠海马神经元损伤，促进神经元自噬体形成及自噬体-溶酶体融合，通过酸化溶酶体室而提高溶酶体组织蛋白酶活性，增加溶酶体途径降解[19-20]。金钗石斛总生物碱提高Aβ25-35诱导小鼠的空间学习记忆能力，减轻小鼠皮层和海马组织损伤，减少神经元凋亡，机制与其上调神经营养因子CNTF、GDNF、BDNF表达有关[21]。金钗石斛总生物碱改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆能力，减轻海马神经元损伤，减少Aβ1-40和Aβ1-42表达，降低自噬泡数量，提高自噬溶酶体清除率，增强Cat D蛋白水解活性，增加v-ATPase A1蛋白表达，促进溶酶体酸化[22]。

金钗石斛总生物碱改善SAMP8衰老小鼠空间认知功能障碍，减轻皮层和海马组织损伤，降低Aβ1-42蛋白水平，减少Aβ生成，增加Aβ降解，上调LC3、Beclin1和Klotho表达，下调p62表达；抑制PERK信号通路，降低calpain 1、GSK-3β和CDK5活性，抑制Tau蛋白高度磷酸化[23-24]。

石斛碱减轻氧糖剥夺/再灌注所致小鼠海马神经元HT22细胞损伤，其机制与抑制细胞焦亡相关蛋白Caspase-1表达有关[25]。

2.2.2 保护肝脏 金钗石斛总生物碱改善CCl4所致小鼠急性化学性肝损伤，减轻肝组织形态和超微结构损伤，减少肝细胞凋亡，降低肝功能相关ALT和AST水平，机制与其抗氧化应激以及抑制炎症反应有关[26-28]。

在高脂饮食诱导脂肪肝小鼠模型中，金钗石斛总生物碱减轻肝脏脂肪变性，降低胆固醇和甘油三酯，减少游离胆汁酸LCA、DCA、CA和CDCA含量，增加牛磺酸结合胆汁酸TMCA、TCDCA、TUDCA和THDCA含量，上调Cyp27a1、Cyp3a11、Fxr和Shp基因表达[29]。

2.2.3 保护心肌 金钗石斛总生物碱改善缺血再灌注诱导的犬心肌损伤，降低心肌对游离脂肪酸FFA的摄取率，下调长链脂肪酰辅酶A(LCACoA)浓度，减少脂肪酸转位酶FAT/CD36异常表达[30]。石斛碱抑制高钠盐所致大鼠心肌成纤维细胞增殖，机制与降低NF-κB p65磷酸化及趋化因子MCP-1表达有关[31]。

2.2.4 降血糖 金钗石斛总生物碱降低高糖高脂复合链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠的空腹血糖和胰岛素，机制与改善胰岛素抵抗，上调肝脏IRS-2、IGF-1和骨骼肌GLUT4表达有关[32-33]。

DNLA：金钗石斛生物碱；β-amyloid aggregates：β-淀粉样蛋白聚集体；Neurofibrillary tangles：神经原纤维缠结；Autophagosome：自噬体；Lysosome：溶酶体；Autophagolysosome：自噬溶酶体。图3 金钗石斛生物碱的神经保护作用机制示意图

2.2.5 抗白内障 在D-半乳糖所致大鼠糖尿病性白内障模型中，金钗石斛总生物碱改善大鼠晶状体混浊，降低晶状体糖基化蛋白表达；金钗石斛总生物碱还可以抑制H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡，缓解晶状体氧化损伤引发的白内障[34]。

2.2.6 抗癌 金钗石斛总生物碱通过线粒体途径诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡[35]。石斛碱与顺铂联合使用抑制非小细胞肺癌，减轻顺铂所致裸鼠心脏毒性；石斛碱单用通过线粒体途径诱导人肺癌A549细胞凋亡[36]。

表1 金钗石斛生物碱的临床前药理作用及机制

表1(续)

3 金钗石斛的临床应用

金钗石斛是中药石斛的主要来源之一。金钗石斛在临床上作为中药用于改善代谢综合征及治疗慢性萎缩性胃炎，关于金钗石斛倍半萜生物碱化合物的临床研究目前少有文献报道。

3.1 改善代谢综合征 代谢综合征是一种常见慢性疾病，以肥胖、血脂异常、高血糖和高血压为临床特征。动物实验表明金钗石斛能够降低血脂、血糖，且无明显副作用。文献报道在单臂、非随机、开放、探索性临床试验中，将30例代谢综合征患者分配到治疗组，受试者每天服用12 g金钗石斛粉(每天两次，每次6 g)，疗程持续8周，随访4周。测定受试者的体重、体重指数BMI，空腹血糖、血脂总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL-c、低密度脂蛋白胆固醇LDL-c、游离脂肪酸，记录研究过程中的不良事件，评估金钗石斛粉的有效性和安全性[37]。

3.2 治疗慢性萎缩性胃炎 慢性萎缩性胃炎是一种消化道疾病，以胃黏膜萎缩性病变为临床特征。动物实验表明金钗石斛促进胃酸分泌，改善胃肠道运动。文献[38]报道在临床试验中，将100例慢性萎缩性胃炎患者随机分配到对照组(50例，予胶体果胶铋和阿莫西林)及治疗组(50例，予石斛养胃汤联合胶体果胶铋和阿莫西林)。对照组每天服用胶体果胶铋600 mg和阿莫西林1.5 g，疗程为1个月；治疗组在对照组基础上每天加服石斛养胃汤(含石斛30 g)，疗程持续1个月。与对照组相比治疗组的临床疗效总有效率更高，慢性萎缩性胃炎症状明显改善，消瘦、食欲不振、腹痛、贫血症状消失或减轻，血清C反应蛋白、IL-6、TNF-α、胃泌素-17、胃蛋白酶原PGⅠ及PGⅡ降低，不良反应发生率较低。

4 展望

金钗石斛是国际二类濒危保护植物，于1987年10月列为国家濒危保护物种。遵义赤水地区的地理环境、气候、岩土等条件非常适合金钗石斛生长，此处种植的金钗石斛品质很好。金钗石斛的人工栽培技术趋近完善，已实现药材规范化种植，并建成赤水金钗石斛GAP基地，充足的药材供给利于金钗石斛的合理开发及深入研究。近年来以石斛碱为质量标志物的金钗石斛质量控制体系逐渐规范，促进了金钗石斛药材生产的标准化。

酸性乙醇提取、酸水溶液浸泡提取、超临界流体萃取等工艺可用于制备金钗石斛生物碱，超声辅助离子交换树脂、超声辅助聚离子液体等新提取技术的出现提高了金钗石斛生物碱的产率，降低了生产成本。在现有提取技术基础上改进方法，研发出提取率更高、成本更低、节能环保的制备工艺，将有利于金钗石斛生物碱的工业化生产。

目前从金钗石斛中分离鉴定的生物碱大多是picrotoxane型倍半萜类生物碱，关于金钗石斛总生物碱的药理作用研究集中在保护神经、肝脏、心肌，降血糖，抗白内障和抗癌等方面。今后采用先进的色谱和波谱技术从金钗石斛中分离鉴定结构新颖的倍半萜生物碱化合物，使用体外细胞模型和体内动物模型研究倍半萜生物碱化合物的临床前药理作用及机制，发现倍半萜生物碱作用的新靶点和新机制，阐明结构-药效关系，为药物研发提供先导化合物。临床上将金钗石斛作为中药使用，但金钗石斛发挥治疗作用的有效组分或成分尚不明确，因此开展更全面的临床试验来确证金钗石斛总生物碱或生物碱化合物的疗效具有重要意义。

市场上已有金钗石斛胶囊、金钗石斛洋参胶囊和金钗石斛葛根西洋参胶囊等多种保健品，但金钗石斛倍半萜生物碱相关的保健品尚未见开发。保健品研发具有成本低、周期短的特点，未来可将金钗石斛倍半萜生物碱作为保健品进行深度开发以适应不同人群的需求。