中药调节DNA高甲基化用药规律的网络药理学及数据挖掘研究*

郭宵飞 李智飘 李静静 张 平△

（1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.北京中医药大学，北京 102400）

DNA甲基化是研究最深入的表观遗传修饰之一。它在染色质结构、抑制内源性寄生序列活性和稳定抑制基因表达中起关键作用，对基于潜在基因序列的基因活动而言，不同基因组区域的DNA甲基化可能会产生不同的影响［1-2］。研究表明，异常的DNA甲基化与肿瘤的发生发展有着密切的联系。低水平及高水平的甲基化有着不同的作用，前者可激活基因的表达导致癌基因表达上调或导致染色体的不稳定性增加，后者可导致部分抑癌基因沉默，增加肿瘤发生的风险［3］。其中DNA高水平甲基化是近年来的研究热点。越来越多的研究发现，甲基化的发生大多数是在正常衰老过程中以一种程序化的方式产生的，这会提高肿瘤发生的危险性［4］。DNA甲基化这一进程是可逆的［5］，因此针对DNA甲基化进行治疗以降低肿瘤的发生率、改善肿瘤患者的预后等成为肿瘤治疗的新思路。中药复方的治疗具有多靶点、多层次、副作用少等特点。已有研究表明，中药在去DNA甲基化方面有着显著的效果，如KUMAR U等［6］研究发现，姜黄素可以影响DNA甲基转移酶3b的转录水平，调控乳腺癌细胞DNA甲基化水平，从而抑制癌细胞生长。然而相关的报道较少，缺乏进一步的研究。本研究基于中药系统网络药理学研究方法，将中药、成分、靶点等层次的信息进行整合筛选，从而展现去DNA甲基化的药物、成分、靶点之间的关系，为进一步探索中医药调节DNA甲基化水平的理论研究、新药研发以及临床用药提供思路和理论依据。

1 资料与方法

1.1 DNA高甲基化相关作用靶点收集 登录Gene-Cards（http：//www.genecards.org）［7］、OMIM（https：//omim.org）［8］、GenCLip 3（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）［9］等数据库，以“DNA hypermethylation”为关键词进行检索，获得与DNA高甲基化相关靶点，并采用蛋白数据库 UniProt（https：//www.uniprot.org/）［10］匹配各个靶点的全称。

1.2 筛选候选化合物及构建化合物-靶点网络 运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com）［11］收集作用于DNA高甲基化相关靶点的化合物，并以DL≥0.18为条件进行筛选，获得DNA高甲基化相关化合物的名称、DL值以及PubChem CID等信息。将潜在靶点、候选化合物导入Cytoscape 3.7.1软件构建靶点-化合物网络。

1.3 获取中药及靶点-化合物-中药网络构建 通过TCMSP收集含有筛选得到的候选化合物的中药，根据2020年版《中华人民共和国药典》（一部）［12］、《中药学》［13］进行筛选，并进行中药名称规范，得到候选中药。最后利用Cytoscape软件构建靶点-化合物-中药网络，根据网络中各个节点的拓扑学参数筛选出核心节点。

1.4 中药数据整理以及频数分析 根据2020年版《中华人民共和国药典》（一部）、《中药学》匹配所获得候选中药的性、味及归经等信息，利用Excel软件进行频数分析。

2 结果

2.1 所获取的作用靶点结果 见表1。通过检索GeneCards、OMIM、GenCLip 3等数据库共收集与DNA高甲基化相关的靶点189个，其中在TCMSP数据库中能匹配到的化合物的靶点有47个，可关联到化合物DL≥0.18的靶点有35个，将这35个靶点定义为潜在靶点。

表1 化合物作用于DNA高甲基化的潜在靶点

2.2 候选化合物及构建靶点-化合物网络 见图1，表2。通过TCMSP检索得到的潜在靶点，共获得1 188个相关化合物。将潜在靶点与候选化合物构建靶点-化合物网络，该网络由1 223个节点与1 509条边构成。网络总节点的度值越大，提示该节点在网络中的枢纽性越强，调控作用越大。网络中，度值最高的前3位的靶点为ESR1、PGR、CHEK1，分别与732、372、236个化合物相关；度值最高的前4位的化合物为（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯［（-）-epigallocatechin-3-gallate）］、槲皮素（quercetin）、金雀异黄酮（genistein）、木樨草素（luteolin），分别与15、15、9、8个靶点相关。选取度值≥2的候选化合物与其关联的潜在靶点构建靶点-化合物网络，图中菱形节点表示靶点，六角多边形节点代表化合物，各节点的大小与度值呈正相关关系。

表2 中药调节DNA高甲基化的潜在核心化合物（度值＞20）

图1 DNA高甲基化相关靶点-化合物网络

2.3 获取的相关中药及构建的靶点-化合物-中药网络 见图2，图3。在TCMSP数据库中匹配所获的1 188种候选化合物，共获得470种中药，通过《中药学》及2020年版中药药典筛选后，共收集到408味中药。构建化合物-中药网络，网络中共含1 596个节点，3 425条边。其中度值最高的前5味中药为甘草、丹参、沙棘、枸杞子、桑白皮，分别含有96、44、35、34、34个候选化合物。以候选化合物为桥接收集各个中药可作用的靶点，包含靶点数目最多的前4味中药为枇杷叶、白果、女贞子、余甘子，预测此4味中药为干预DNA高甲基化的核心。选取度值≥4的候选化合物及度值≥10的中药与其关联的潜在靶点构建靶点-化合物-中药网络。图中方形的节点代表中药，菱形的节点表示靶点，六角多边形的节点代表化合物，节点大小与度值高低呈正相关。

图2 相关中药的关联候选化合物及作用靶点（前15位）

图3 靶点-化合物-中药网络

2.4 分子对接结果 见表3，图4。将高度值靶点PGR（PDB ID：1SQN）、CHEK1（PDB ID：2YEX）、CDKN1A（PDB ID：5E0U）、BCL2（PDB ID：6GL8）、ESR1（PDB ID：7BAA）与高度值化合物槲皮素、西托糖苷、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇分别进行分子对接。结合能＜-5.0 kcal/mol表示靶点与化合物有较好的结合活性。对接结果显示，各靶点与化合物的对接结合能均＜-5.0 Kcal/mol，提示其结合活性良好。其中，β-谷甾醇与PGR的结合能最佳，为-9.3 kcal/mol，基本验证了靶点与化合物之间有着密切关联。将4个结合能小于-8.5 Kcal/mol的对接结果进行展示。

表3 核心潜在靶点与候选化合物分子对接结果（kcal/mol）

图4 部分核心潜在靶点与候选化合物分子对接示意图

2.5 候选中药的性味与归经统计结果 见表4～表6。匹配所获得的408种中药的四气、五味及归经信息并利用Excel进行频数统计，结果显示，可干预DNA高甲基化的中药药味以苦、辛、甘为主，药性以温、寒居多，主要归肝、肺二经。

表4 调节DNA高甲基化中药的药性分布

表5 调节DNA高甲基化中药的药味分布

表6 调节DNA高甲基化中药的归经分布

3 讨论

DNA甲基化是影响基因活动的主要表观遗传因素之一。DNA甲基化大多数发生在CpG位点之前的胞嘧啶或鸟嘌呤核苷酸上，不同区域的DNA甲基化可能对基因活动产生不同的影响［1］。DNA高甲基化对于癌症的发生发展有着一定的影响，有研究发现减少小鼠模型中的甲基化也被证明可以在特定情况下预防癌症形成。另外，众多研究发现基因高甲基化与肿瘤治疗反应差有关［14］。随着DNA甲基化作为新的癌症筛查指标以及治疗作用靶点的广泛应用，中药干预DNA高甲基化的研究开始进入科研人员及临床医师的视线，探索可干预DNA高甲基化的中药单药或复方对临床治疗和新药的研发具有重要意义。本次研究运用网络药理学的方法，基于多个数据库，以DNA高甲基化相关靶点作为切入点，匹配出相关的化合物及中药，构建靶点-化合物-中药网络，对中药干预DNA高甲基化的物质基础以及用药规律进行了较为系统的分析预测。

根据靶点-化合物网络，度值最高的化合物有β-谷甾醇、槲皮素、西托糖苷、豆甾醇、山柰酚等。槲皮素是黄酮类化合物中黄酮醇类的重要黄酮类化合物之一，既往研究表明，槲皮素具有通过表观遗传控制机制发挥部分抗癌作用的能力，它能以浓度依赖的方式抑制部分DNA甲基化［15］。Tan S等通过研究证明槲皮素可以通过诱导CDKN2A基因启动子去甲基化并在80 mM浓度下增强基因表达从而抑制人结肠癌细胞的生长［16］。山柰酚抗肿瘤活性的假设作用机制包括阻断细胞周期进程、诱导凋亡、抑制环氧化酶-2等［17］。调控DNA甲基化也是其作用机制之一。Wei Qiu等通过使用山柰酚治疗膀胱癌裸鼠发现山柰酚调节了膀胱癌中的DNA甲基化，诱导了多个与基因相关的差异DNA甲基化位置，并观察到山柰酚特异性抑制DNMT3B的蛋白质水平，而不改变DNMT1或DNMT3A的表达［18］。槲皮素及山柰酚都是黄酮类化合物，两者存在于许多水果和蔬菜中，可为DNA高甲基化的食疗提供方向和理论依据。

通过筛选所获得的中药中，干预DNA甲基化靶点数目最多的前4味中药为枇杷叶、白果、女贞子、余甘子。枇杷叶、白果、女贞子、余甘子均含有黄酮类成分，黄酮类化合物中拥有一个黄烷核，研究发现，这种结构通过抑制DNA甲基转移酶来抑制DNA甲基化［19］，这或许是4味中药干预DNA高甲基化的机制之一。有研究表明，女贞子表现出对p16基因表达的促进作用以及去甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞的增殖［20］。其余中药干预DNA高甲基化的相关报道较少，有待进一步研究。

根据频数分析显示，干预DNA高甲基化的中药药味以苦、辛、甘为主，药性以温、寒居多。其主要归经为肝、肺二经，脏病多虚，故以甘味补之。辛味能散能行，苦味能泻能燥，二者一通一降，开泄并用，可行气、去热、化痰，加以甘味防止疏泄太过。肝主疏泄、主藏血，主升主动，肺主气，主行水，朝百脉，二者一升一降，推动全身气血运行。DNA高甲基化以抑制抑癌基因的激活为机制之一，肝肺推动气血的运行或许是调控这一机制的重要方式。临床用药应可以行气活血、补益和中、祛寒清热为主，疏肝理肺。

随着人们对于DNA甲基化研究的进展，以DNA甲基化为靶点的治疗方法正不断被提出。中药治疗疾病有着多靶点、多通路并且耐药性低的特点，在干预DNA高甲基化方面有着独特优势，但目前关于中药对DNA去甲基化作用的研究多局限于中药提取物，难以发挥中医药复方整体治疗的特点。本研究通过网络药理学的方法，以DNA高甲基化相关靶点为切入点，系统探讨了中药干预DNA高甲基化的物质基础及用药规律，为中药干预DNA高甲基化的研究以及临床用药提供了一定的借鉴。本研究的数据主要从网络数据库收录获得，借助网络构建的方法，只能显示靶点、化合物、中药之间的关系数量，未能兼顾不同人群、肿瘤类型等因素所带来的影响，具有一定局限性，故研究结果仍需进一步实验验证。