miR-181a-5p对人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

夏煜星， 廖崇珊， 康非吾

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科，上海 200072）

在骨损伤的修复过程中，骨愈合和骨代谢的能力决定了患者的预后情况及术后的生活质量[1]。骨折的修复是一个复杂连续的过程，包括了血肿机化、骨痂形成等[1]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化过程在骨愈合中起了关键作用[2]。在成骨分化早期，碱性磷酸酶（ALP）表达上调，成骨分化后期，骨钙素（osteocalcin，OCN）、Runx2基因表达相对明显[3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内生的、长度为20~24 nt的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。miRNA可介导不同组织之间的旁分泌和内分泌通信，从而调节基因表达和远端细胞的功能；其也可作为疾病诊断和预后判断的重要生物标志物[4-5]。研究发现，miR-181a在骨代谢过程中可通过双特异性磷酸酶6（dual-specificity phosophate 6，DUSP6）诱导破骨细胞分化，并且负调控破骨细胞凋亡[6]。但是，在成骨过程中miR-181a所起的作用尚不明确。因此，本研究通过对人BMSCs中的miR-181a-5p进行过表达和沉默，观察其在成骨过程中的变化，从而为骨折术后促进快速恢复找到新的治疗方向提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

因正颌手术需要而切除的颌骨碎片来自同济大学附属口腔医院，本研究经同济大学附属口腔医院伦理委员会审批[批准号（2019）-R-011]。 α-MEM培养液、胰蛋白酶、青霉素/链霉素、盐酸缓冲液（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS；Excell Bio公 司 ， 澳 大 利 亚 ）；Lipofectamine 3000（Invitrogen公司， 美国）；RNAiso Plus、Prime-ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa公司，日本）；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、多聚甲醛 （国药集团化学试剂有限公司，中国）；DEPC水（生工生物工程股份有限公司，中国）；碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒 （南京建成生物工程研究所，中国）；人BMSCs成骨诱导液、茜素红染色液（赛业生物科技有限公司，中国）；Human MSC Analysis Kit试剂盒 （BD公司，美国）；Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix（翌圣生物科技上海股份有限公司，中国）；One-StepTMNBT/BCIP（碧云天公司，中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 人BMSCs的分离和培养 无菌技术下取得正颌手术中废弃的颌骨骨松质，用大量磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗后以350×g离心5 min，弃上清液，再用含10%FBS的α-MEM培养液重悬之后连同剪碎的颌骨骨碎接种于6孔板中，进行常规细胞培养。等到细胞融合约80%时，消化传代，记为P1代。之后用胰酶消化后常规传代培养，取P3~5代细胞用于实验。

1.2.2 人BMSCs的鉴定 取P2代人BMSCs，用胰蛋白酶消化并中和后用PBS洗涤，倒去上清液。用PBS重悬并调整细胞密度为1×106/mL，以500 μL每管将其分装至流式管中，分别加入荧光直标CD105、CD90、CD73、CD44抗体5 μL后，于室温下避光孵育30 min，使用PBS洗涤2遍后重悬，用流式细胞仪检测干细胞相关表面标志。

1.2.3 人BMSCs的转染 参照脂质体Lipofectamine 3000试剂说明书，依据锐博生物公司推荐的浓度，miRNA mimic浓度为50 nmol/L，miRNA inhibitor浓度为100 nmol/L，normal control（NC）组浓度为50 nmol/L。分别将miR-181a-5p inhibitor组（miR-181a-5p沉默组）、miR-181a-5p mimic组（miR-181a-5p过表达组）、NC组（对照组）转染人BMSCs 24 h，另设未转染组为control组。转染后检测BMSCs的表达，验证转染效果。

1.2.4 成骨诱导 根据赛业生物科技有限公司的成骨诱导液使用说明书，小心吸走完全培养液后加入成骨诱导液，每3天换液。

1.2.5 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR） 使用传统TRIzol法抽提RNA，然后通过逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix将RNA逆转录为cDNA，以逆转录产物cDNA为模板,采用Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix进行RT-qPCR。表1为miR-181a-5p、COL1、Runx2、OCN及 内 参U6、GAPDH的引物序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.6 ALP染色及定量分析24孔板中的BMSCs用4%多聚甲醛固定30 min，吸去固定液，用PBS洗涤2次/5 min，每孔加入200 μL One-StepTMNBT/BCIP溶液完全覆盖培养皿底部，在室温下避光染色1 h，用PBS洗去多余染液，于倒置显微镜下观察并拍照。根据ALP活性测定试剂盒说明书进行操作，检测各组细胞上清液中的ALP活性。

1.2.7 茜素红染色24孔板中的人BMSCs用4%多聚甲醛固定30 min，吸弃固定液后用PBS洗涤2次，每孔加入2%茜素红染液200 μL，室温下避光染色30 min，用双蒸水洗去多余的染液，于倒置显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学处理

应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，3个样本均数比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 人BMSCs形态学观察、鉴定和转染

颌骨碎片经培养7~10 d后，光镜下沿骨片周围有散在单个细胞爬出（图1A），呈长梭形贴壁生长。传代培养7 d后，可见细胞繁殖呈漩涡聚集状（图1B）。为了进一步探究miR-181a-5p的作用，在诱导BMSCs成骨样分化期间使用miR-181a-5p mimic和miR-181a-5p inhibitor转染细胞以过表达和沉默miR-181a-5p。RT-qPCR检 测 结 果 显 示 ，miR-181a-5p mimic组细胞内miR-181a-5p的表达显著高于NC组,miR-181a-5p inhibitor组细胞内miR-181a-5p的表达显著低于NC组,表明细胞过表达和沉默miR-181a-5p成功（图3C）。传至P4代，采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志物的表达，结果显示，CD90、CD73、CD44、CD105的阳性表达率分别为92.4%、92.3%、92.1%、91.9%（图1D—G）。

图1 人BMSCs的形态学观察、鉴定及转染Figure 1 Morphological observation,identification and transfection of human BMSCs

2.2 成骨诱导7 d的ALP染色和ALP活性检测结果

成骨诱导7 d后，取细胞上清液进行ALP活性检测，miR-181a-5p mimic组的ALP水平比control组更高（P<0.001），而miR-181a-5p inhibitor组无明显变化 （图2A）。光镜和直观下可见，miR-181a-5p mimic组的ALP染色比control组表达更高，而miR-181a-5p inhibitor组则相对表达较低（图2B、C）。

图2 ALP染色和ALP活性检测Figure 2 ALP staining and detection of ALP activity

2.3 成骨诱导21 d的ALP和茜素红染色结果

成骨诱导21 d后，ALP染色光镜下和直观下可见control组、miR-181a-5p mimic组和miR-181a-5p inhibitor组无明显差异（图3A、B）。茜素红染色光镜下和直观下可见miR-181a-5p mimic组比control组表达更高，可见矿化结节，而miR-181a-5p inhibitor组表达相对较低（图3C、D）。

图3 ALP染色和茜素红染色Figure 3 ALP staining and alizarin red staining

2.4 RT-qPCR结果

成骨相关基因COL1、Runx2在miR-181a-5p mimic组中的表达比control组中更多 （P<0.05），而OCN表达更少（P<0.05）。COL1在miR-181a-5p inhibitor组中的表达比control组少（P<0.001）。详见图4。

图4 RT-qPCR检测成骨相关因子COL1、Runx2、OCNFigure 4 Detection of osteogenic related factors COL1,Runx2 and OCN by RT-qPCR

3 讨论

在骨折术后恢复期中，骨改建的过程非常复杂，并且至关重要，BMSCs、成骨细胞、破骨细胞在其中相互影响。而基于BMSCs再生的疗法是目前主流的研究趋势[7]。miRNA广泛参与细胞的发育、增殖、分化和凋亡，并且多种生理过程和病理结果高度依赖于miRNA的作用。许多研究证实miRNA在骨代谢过程中发挥了极其重要的调控作用，参与维持骨代谢的平衡[8-10]。Li等[11]发现了手部或关节骨折患者血浆中miR-214-5p的高表达，并证明了miR-214-5p下调的重要性，从而增强了成骨细胞的活力和抗凋亡能力。有学者在小鼠股骨横向骨折部位注射miR-218过表达细胞，在骨折后2周和4周时，与对照组相比，miR-218组骨体积显著增加，表明miR-218对 骨 再 生 有 促 进 作 用[12]。Lee等[13]证 明 了miR-29b-3p在股骨骨折愈合中有意义的治疗效果，体内研究表明，通过超声系统单次注射miR-29b-3p，14 d后骨折明显愈合。

miR-181a-5p作为miRNA家族中的重要成员，可通过调控不同的靶基因或信号通路参与细胞的生物学过程。miR-181a-5p是一种与骨代谢关系密切的基因，在多种间充质干细胞分化时表达，可发挥成骨基因或破骨基因的作用参与细胞的生物学活动。本研究发现了miR-181a-5p是BMSCs成骨分化过程中一个重要的miRNA，在此过程中，miR-181a-5p过表达会促进成骨分化，从而加快骨愈合过程。

然而，本研究对miR-181a-5p在成骨分化中的作用尚不清楚。学者发现，血管平滑肌细胞成骨样分化时，下降的miR-181a-5p可抑制成骨样分化，其可能的机制是抑制促钙化信号转导分子MAPK1和MAPK8的表达[14]。TGF-β/BMP和wnt/β-catenin通路在转录后被不同的miRNA调控，从而促进或抑制成骨。具体来说，miRNA可以直接增加或降低信号通路成分和/或参与成骨分化的基因表达，最终对成骨过程产生刺激和抑制作用[15]。miR-23b、miR-30、miR-34c、miR-133、miR-135a、miR-137、miR-143、miR-203、miR-204、miR-205、miR-221、miR-505可 通过调控成骨相关靶基因Runx2来影响成骨分化过程[16]。而对于成骨相关的重要信号通路TGF-β/BMP来 说 ，miR-155、miR-195-5p、miR-93-5p、miR-98、miR-140-5p起了一定的调控作用[17-19]。

综上所述，本研究证明了miR-181a-5p对人颌骨BMSCs的成骨分化具有促进作用，从而为正颌术后骨愈合的治疗方法提供了新的思路和方向。