RNF43靶向PTEN进行泛素化修饰抑制人胃癌细胞AGS增殖与迁移

邵 笑，魏从文，闵 敏，董瑞华,4

胃癌(gastric cancer，GC)是五大常见肿瘤之一，目前中国已经成为胃癌发病人数和死亡人数均居高位的国家[1]。探寻新的治疗靶点，对于提高胃癌疗效，改善预后有重要的科学意义和应用价值[2]。

环指蛋白43 (ring finger 43，RNF43)具有环状的泛素连接酶结构域和跨膜区，属于跨膜的E3泛素连接酶[3-4]。研究[5]表明RNF43可以与Wnt/β-catenin信号通路中的受体蛋白Frizzled结合，泛素化卷曲受体蛋白并诱导该蛋白降解，进而抑制Wnt信号通路的活性发挥抑癌作用。前期研究[6]表明RNF43在胃癌中的表达较高，其作为胃癌中的生物标志物具有较高的研究价值。目前针对RNF43泛素化底物蛋白的研究较少，该实验通过对RNF43作用新靶点发现与验证，进一步明确RNF43在胃癌细胞中的分子机制，为胃癌的靶向治疗提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 细胞与质粒人胃腺癌细胞AGS由军事医学科学院八所四室保存；不同标签的RNF43质粒(Flag-RNF43、HA-RNF43、GFP-RNF43)、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN)质粒Flag-PTEN、HA-PTEN购自北京义翘神州生物技术责任有限公司；泛素(Ubiquitin, Ub)质粒Myc-Ub及泛素48位、63位特异性泛素化的质粒Myc-Ub(K48)、Myc-Ub(K63)由实验室保存。

1.2 主要试剂RPIM-1640培养基、胎牛血清购于美国Gbico公司；α-tubulin抗体购于美国Cell signaling technology公司；抗RNF43、PTEN抗体购于美国Abcam公司；转染试剂购于法国Ployplus公司；PTEN选择性抑制剂bpV (Hopic)、蛋白酶体抑制剂MG132购于美国Selleck公司；细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)购于日本东仁化学科技有限公司；ANNEXIN V- FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国Solarbio公司。

1.3 主要仪器恒温细胞培养箱(型号：3111)、超净工作台(型号：1384)购于美国Thermo公司；荧光倒置显微镜购于尼康仪器上海有限公司；恒压恒流电泳仪(型号：164-5052)购于美国Bio-Rad公司；快速转膜仪(型号：NovexTM)、流式细胞仪(型号：Attune NxT)购于美国Invitrogen公司；酶标仪(型号：Spark 20M)购于瑞士TECAN公司。

1.4 方法

1.4.1细胞培养 用含有10%胎牛血清的RIPM-1640细胞培养基在37 ℃、5%CO2条件下培养AGS细胞。注意观察培养基颜色以及显微镜下细胞密度，及时给细胞更换培养基、传代。

1.4.2细胞的瞬时转染 准备四皿人胃腺癌细胞AGS，其中一皿作为空白对照组，转染前更换细胞培养基，待细胞密度为80%左右时准备转染。分别准备3个1.5 ml EP管，管中分别加入2、4、8 μg RNF43绿色荧光质粒和200 μl buffer缓冲液，震荡15 s后静置5 min；再分别加入4、8、16 μl转染试剂，震荡15 s后静置10 min。将混合液分别转移至3皿AGS细胞中，4～6 h后更换细胞培养基，24 h后显微镜下观察细胞荧光或收集细胞样品，观察细胞荧光前用DAPI对细胞核进行蓝色荧光染色。

1.4.3Western blot分析 准备四皿AGS细胞，分别转染0、1、2、4 μg的Flag-RNF43。收集不同处理组细胞，裂解后离心收集上清液。用BCA法测定蛋白样品浓度并加入SDS高温煮沸制备蛋白样品。用SDS-PAGE分离胶分离蛋白，转膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭；一抗4 ℃孵育过夜(α-tubulin抗体稀释比例为1 ∶5 000；HA、Flag、Myc标签抗体稀释比例为1 ∶2 000；RNF43、PTEN抗体稀释比例为1 ∶1 000)，TBST洗涤后二抗孵育1～2 h(山羊抗兔、山羊抗小鼠抗体稀释比例为1 ∶5 000)，ECL化学发光显影。以α-tubulin条带为内参对照，Image J软件分析RNF43及PTEN的蛋白相对表达量。

1.4.4免疫共沉淀分析 准备六皿AGS细胞，其中三皿中同时过表达HA-RNF43、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)；另外三皿中分别过表达HA标签的空载体质粒：HA-Vector、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)。细胞转染处理24 h后，加入NP40裂解液冰上裂解30 min，离心取上清液。上清液分成两部分：一部分直接加入SDS，水浴煮沸制备Input细胞蛋白样品；另一部分加入Flag标签的磁珠，4 ℃摇床孵育过夜，离心弃去上清液，NP40洗液反复清洗磁珠3次后制备IP细胞蛋白样品。注意细胞收样前8 h加入40 nmol/ml的蛋白酶体抑制剂MG132。

1.4.5CCK-8检测细胞增殖 Bisperoxovanadium (HOpic)[bpV (HOpic)]是一种有效的和具有选择性的PTEN抑制剂，其IC50为14 nmol/L[7]。将AGS细胞分组，分别用bpV (HOpic)、RNF43处理。将不同处理组的AGS细胞接种至96孔板中，每组3个复孔。待细胞贴壁后6、12、24、36、48、72 h，用酶标仪测定细胞在450 nm波长的吸光度值，绘制增殖曲线来评估细胞的增殖能力。

1.4.6流式细胞仪检测细胞凋亡 将AGS肿瘤细胞分为Control组、RNF43组、bpV (HOpic)组及RNF43+bpV (HOpic)组，每组设置3个重复样品。48 h后将不同处理组的AGS细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS清洗2次，收集细胞。加入150 μl结合液将细胞重悬转移至流式管中，分别加入5 μl AnnexinV-FITC、PI避光孵育15 min，流式细胞仪检测AGS细胞凋亡情况(Q3为早期凋亡细胞，Q2为晚期凋亡细胞，通过计算Q2与Q3细胞分布总和，计算细胞凋亡总比例)。

1.4.7划痕实验检测细胞迁移 将AGS肿瘤细胞分成Control组、RNF43组、bpV (HOpic)组及RNF43+bpV (HOpic)组，在6孔板中培养、处理AGS，每组设置3个复孔。待细胞密度达到100%后用200 μl无菌移液枪头垂直与板面划痕，每孔划痕PBS洗涤3次后加入不含血清的培养基，在显微镜下观察划痕两侧细胞在0、12、24 h的迁移情况，拍照记录，Image J软件分析划痕宽度变化。

1.5 统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学分析，每组数据重复3次。多组样本间比较采用单、双因素方差分析，两两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF43在AGS细胞中的瞬时转染随着RNF43转染量的增加，细胞绿色荧光增加。蓝色荧光为DAPI对AGS细胞核的染色。见图1。

图1 GFP-RNF43在AGS中的表达 ×40a: DPAI蓝色染细胞核；B: 绿色荧光标记2 μg RNF43蛋白表达；C: 绿色荧光标记4 μg RNF43蛋白表达；D: 绿色荧光标记8 μg RNF43蛋白表达；蓝色荧光标记细胞核

2.2 RNF43对PTEN蛋白表达水平的影响Western blot结果显示，随着RNF43的表达量增加，内源PTEN的蛋白表达量也随之增加，其中过表达2、4 μg RNF43时差异有统计学意义(F=25.38，P<0.01，P<0.001)，见图2A、B。免疫共沉淀结果显示RNF43与PTEN存在相互作用，见图2C。

图2 AGS中RNF43与PTEN的相互作用A：RNF43对AGS细胞内源PTEN蛋白表达水平的影响；B：PTEN的内源蛋白水平变化；C：RNF43与PTEN的蛋白相互作用；a～d:Flag-RNF43的转染量0、1、2、4 μg；与Control组(0 μg)比较：**P<0.01，***P<0.001

2.3 RNF43对PTEN的蛋白表达泛素化修饰的影响Western blot结果显示，在AGS过表达RNF43之前，AGS细胞内即存在蛋白水平的泛素化调控，而当AGS中RNF43蛋白水平高表达后，细胞的泛素化水平增强，PTEN蛋白表达增强。其中以泛素分子K63位点进行特异性泛素化修饰的蛋白水平显著增加：Ub(K63)+ RNF43组与Ub(K63)对照组的Ub蛋白水平存在差异(t=5.081，P=0.037)；Ub(K63)+ RNF43组与Ub(WT)+ RNF43组的Ub蛋白水平存在差异(t=6.945，P=0.020)。见图3。说明RNF43主要通过K63的泛素化方式靶向修饰PTEN并增加PTEN的蛋白表达水平。

图3 RNF43对PTEN的泛素化修饰A：AGS不同处理组的RNF43、PTEN及Ub的蛋白表达情况；B：AGS不同处理组中Ub的蛋白相对表达量；a:AGS高表达Ub组；b:AGS高表达Ub(K48)组；c:AGS高表达Ub(K63)组；d:AGS高表达Ub和RNF43组；e:AGS高表达Ub(K48)和RNF43组；f:AGS高表达Ub(K63)和RNF43组；与AGS高表达Ub(K63)组比较：*P<0.05；与AGS高表达Ub和RNF43组比较：#P<0.05

2.4 RNF43通过增加PTEN的表达对AGS细胞增殖的影响CCK-8实验结果显示，相较于Control组，RNF43组AGS肿瘤细胞增殖能力降低，差异有统计学意义(F=26.46，P<0.01)；而相较于RNF43组，bpV (HOpic)+RNF43组AGS肿瘤细胞增殖能力提高，差异有统计学意义(F=33.26，P<0.05)。见图4。表明RNF43可通过增加PTEN的表达来抑制AGS肿瘤细胞的增殖。

图4 CCK-8检测AGS细胞增殖变化与RNF43组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.5 RNF43通过增加PTEN的表达对AGS细胞凋亡的影响流式细胞实验结果中Q2、Q3比例之和为肿瘤细胞凋亡的比例。Control组凋亡细胞占总肿瘤细胞数量的16.95%；bpV (HOpic)组48 h之后凋亡细胞比例为8.79%；RNF43组凋亡细胞比例为43.66%，细胞凋亡比例增加；bpV (HOpic)+RNF43组细胞凋亡比例为35.29%。与Control组相比，RNF43组AGS肿瘤细胞凋亡比例增加，差异有统计学意义(t=10.87，P=0.000 4)；与RNF43组相比，bpV (HOpic)+RNF43组AGS肿瘤细胞凋亡减少，活细胞数量增加(t=3.341，P=0.028 8)，差异有统计学意义。见图5。说明加入RNF43之后加强了AGS肿瘤细胞内源PTEN的表达，对肿瘤细胞活性抑制加强，使肿瘤细胞凋亡增加。

图5 AGS细胞凋亡变化A：流式细胞仪检测AGS不同处理组细胞凋亡情况；B：AGS肿瘤细胞活性情况直方图；a:Control组；b:bpV (HOpic)组；c:RNF43组；d: bpV (HOpic)+RNF43组；与RNF43组比较：*P<0.05，***P<0.001

2.6 RNF43通过增加PTEN的表达对AGS迁移的影响细胞迁移结果显示，随着时间延长，细胞划痕之间间隙逐渐缩小；与Control组相比，RNF43组AGS肿瘤细胞增长速度缓慢(t12 h=45.65，t24 h=88.03，P<0.000 1)；与RNF43组相比，bpV (HOpic)+RNF43组AGS肿瘤细胞的增长速度较快(t12 h=14.71，t24 h=39.70，P<0.000 1)，差异有统计学意义。各组间迁移能力的变化差异表明RNF43对PTEN的表达起到了增强作用,并抑制了AGS的迁移。见图6。

图6 AGS细胞迁移能力的变化A：AGS不同处理组细胞迁移能力变化；B：AGS不同处理组细胞迁移率直方图；与RNF43组比较：***P<0.001

3 讨论

胃癌患者临床前期症状无特异性，确诊时大多已进入进展期或晚期，预后较差。寻找胃癌新的分子靶点，对改善胃癌患者的临床疗效具有重要意义[8]。近年来RNF43被认为是胃癌的发生发展中重要的生物标志物，研究[9]表明RNF43是Wnt信号通路经典的拮抗剂，其主要通过与卷曲蛋白frizzled结合并对其进行泛素化降解来抑制信号通路的活性，RNF43也可以通过影响T细胞因子4在细胞内的聚集来发挥Wnt信号通路拮抗剂的作用[10]。PTEN作为抑癌基因在胃癌细胞中高表达[11]，而泛素化是影响PTEN蛋白表达的重要调控机制——PTEN的单泛素化可以促进PTEN的核转移，使其在细胞中表达增加，抑制肿瘤细胞的增殖[12]。

该研究探讨了在人胃腺癌细胞AGS中RNF43的蛋白表达、对细胞内源PTEN蛋白表达以及对AGS细胞功能的影响。RNF43在肿瘤中的作用是多样的：它在结直肠癌、胃癌、大肠癌等消化道肿瘤中发挥抑癌作用，而在肝癌中则可以加速肿瘤的发生发展。这种不同肿瘤中抑癌与促癌作用的差异，推测与RNF43特异性的化学结构有关。泛素化是蛋白质修饰的重要方式之一，而E3连接酶在这一过程中发挥重要作用。从结构上来说，RNF43属于E3连接酶，可以通过对不同的底物蛋白进行泛素化修饰，使蛋白降解或表达增强，进而加速细胞的凋亡或增殖。本研究中的泛素化实验证实了PTEN是RNF43泛素化修饰的底物蛋白，RNF43的蛋白高表达会使AGS细胞内源PTEN蛋白表达增加。实验中AGS细胞增殖、迁移及细胞凋亡实验均证明了RNF43对PTEN蛋白表达水平的调控作用会进一步影响细胞功能。然而，研究[13]已知PTEN主要在PI3K/AKT通路中发挥重要调控作用，所以RNF43对PTEN蛋白表达水平的影响是否会间接影响PI3K/AKT信号通路的活性仍需要继续探究。

综上所述，实验表明，在人胃腺癌细胞AGS中，RNF43蛋白表达增加会使PTEN蛋白表达水平升高，并且PTEN是RNF43泛素化修饰的底物蛋白。细胞功能实验证实RNF43会通过影响PTEN的蛋白表达抑制AGS肿瘤细胞的增殖、迁移并加速其凋亡。因此，RNF43不仅可以作为胃癌患者预后指标，同时它可通过调控不同蛋白的表达发挥抑癌作用，是重要的抑癌靶点，具有一定的深入研究价值。