侗药马卡列丙提取物对成骨细胞增殖、分化、矿化的影响

1.湖南医药学院侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000；2.湖南医药学院基础医学院，湖南 怀化 418000；3.湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000

马卡列丙又称毛秀才，为菊科植物显脉旋覆花属显脉旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的全草，具有通经活络止痛、祛风除湿、活血化瘀、消肿散血等作用，主要用于跌打损伤、骨折的治疗，可显著缩短骨折愈合的病程，是侗族从古至今常用的跌打损伤特效良药[1-4]。迄今为止，从马卡列丙药材提取分离的化合物已报道有60多个，主要有挥发油类、甾体、萜类、黄酮等成分[5-8]。但是马卡列丙促进骨折愈合相关的药理活性研究未见报道，主要有抗炎、抗氧化等作用[9-11]。小鼠成骨细胞MC3T3-E1是研究骨形成的重要细胞模型，骨折愈合和骨质疏松症相关药物研究多采用该细胞进行药效评价[12-13]。实验将马卡列丙的根茎粉碎后用不同的溶剂和方法得到8种提取物，利用小鼠成骨细胞对该提取物进行活性筛选，确定有活性的部位。实验结果有助于侗药马卡列丙的进一步研究和开发，为其治疗跌打损伤和促进骨折愈合的药效物质基础研究提供药理实验依据。

1 材料与方法

1.1 药材及其制备 马卡列丙药材购自于云南，经湖南医药学院汪冶教授鉴定为菊科显脉旋覆花Duhaldeanervosa(Wallich ex Candolle)A.Anderberg的根和根茎，其提取物制备方法如下所示。

1.1.1 挥发油和剩余水提物 药材粉碎，过3号筛，称取200 g，加入6倍量的纯化水，采用2015版《中国药典》2204挥发油测定法，蒸馏提取6 h，蒸馏液经油水分离器分离出油层，加10%的无水硫酸钠脱水，滤过，即得挥发油(I)，得率为0.23%，将上述提取液过滤，续滤液备用，残渣，继续加6倍量的纯化水，加热回流提取2 h，过滤，合并续滤液，减压回收至干，即得剩余水提物(Ⅱ)，得率为37.96%。

1.1.2 石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位 药材粉碎，过3号筛，称取200 g，加热回流提取3次，每次均加入6倍量的95%乙醇溶液，回流提取1 h，合并续滤液，减压回收至干，即得醇提物(Ⅲ)，得率为5.41%，取部分醇提物，加适量水溶解，分别依次用2/3倍体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，减压回收石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水液，即得石油醚部位(Ⅳ)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)，得率分别为0.34%、0.56%、1.24%和2.89%。

1.1.3 粗多糖 药材粉碎，过3号筛，称取50 g，加热回流提取3次，每次均加入10倍量的纯化水，回流提取1 h，合并续滤液，减压回收至50 mL，即得水提液浓溶液。以1 mL/min的速度，加入无水乙醇，边加边搅拌，使其最终醇浓度为80%，静置，过滤，取沉淀，干燥即得粗多糖(Ⅷ)，得率为5.2%。

1.1.4 药物配制 分别称取适量提取物用二甲基亚砜进行溶解配置成200 mg/mL的母液，置于-20 ℃保存备用。

1.2 试剂 α-MEM培养液、胰酶、青霉素/链霉素(Hyclone公司)；胎牛血清(四季青公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、 β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松(Dexamethasone，DEX)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)购自sigma公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。

1.3 细胞株和细胞培养 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。基础培养液为α-MEM，添加10%的胎牛血清和1%的青霉素与链霉素做为生长培养液。诱导分化培养液在生长培养液的基础上添加10 mM β-甘油磷酸钠和50 μg/mL的维生素C。MC3T3-E1用生长培养液进行传代，3～4 d传代一次，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。

1.4 仪器 倒置相差显微镜(Motic AE2000)；二氧化碳细胞培养箱(Thermo scientific)；多功能酶标仪(Biotek)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.5 MTT法检测细胞增殖 取对数期的MC3T3-E1细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后按5×103个细胞每孔接种于96孔板，培养过夜待细胞贴壁生长状态良好进行药物处理，药物处理时间分别为24 h、48 h和72 h，处理完后每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，去掉上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解形成紫色甲瓒，充分振荡混匀后用酶标仪检测490 nm的吸光值。

1.6 碱性磷酸酶活性测定 取对数期的MC3T3-E1细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后按1×105个细胞每孔接种于12孔板，第2天用诱导分化培养液进行药物处理，药物处理每3天更换1次，第6天进行碱性磷酸酶活性测定。药物处理完后，将培养板放在冰上，用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗2次，再每孔加80 μL的RIPA裂解液在冰上裂解30 min。用移液枪将裂解液转移到1.5 mL离心管，12000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清液按操作说明进行碱性磷酸酶活性测定，用酶标仪检测405 nm的吸光值，根据标准曲线和测定值计算出样品中的碱性磷酸酶的单位酶活。

1.7 马卡列丙提取物促进成骨细胞矿化程度评估 细胞悬液计数后，按5×104/孔接种于24孔板，第二天用诱导分化培养液进行药物处理，每3天更换新的药物处理1次，培养14天后进行茜素红染色。去掉培养液后用PBS洗2次，用95%乙醇固定15 min， PBS洗2次，0.1%茜素红37 ℃恒温染色30 min，PBS洗1次，吹干，相差显微镜进行拍照。采用10%的氯化十六烷吡啶对矿化结节进行溶解，用酶标仪测540 nm吸光值来评估细胞的矿化水平，进行量化评估。

1.8 统计学处理 采用Graphpad prism 5软件进行统计学分析，所有实验数据采用平均值加减标准误(S.E.M)表示。多组数据间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05 为有统计学差异。

2 结果

2.1 马卡列丙提取物对成骨细胞增殖的影响 用马卡列丙提取物分别对小鼠成骨细胞进行处理，终浓度分别为50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，处理的时间为24 h、48 h和72 h，其中24 h促进细胞增殖的作用最显著(图1)。48 h和72 h药物促进细胞增殖作用不明显，因为贴壁细胞会有接触性抑制作用，24 h内是细胞生长旺盛期，增殖作用比较显著。与溶剂对照组DMSO相比，正丁醇部位(Ⅵ)在50～800 μg/mL药物浓度作用下都有促进增殖作用。醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(V)在100～800 μg/mL作用下有促进增殖作用。水部位(Ⅶ)在50～100 μg/mL具有促进增殖的趋势，随着浓度增高对细胞活力没有抑制作用。剩余水提物(Ⅱ)没有表现促进增殖的作用，但是对细胞活力在50～800 μg/mL都没有影响。挥发油(I)在100 μg/mL对细胞增殖有促进的趋势，随着浓度增高对细胞活力具有抑制作，400～800 μg/mL 有显著性差异。石油醚(Ⅳ)从50 μg/mL开始对细胞活力有一定抑制作用，800 μg/mL有显著性差异。从药物对细胞活力的影响进行综合评价，醇提物(Ⅲ)和乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)的增殖活性作用比较好(图1 F)。

注：与溶剂对照相比，*P<0.05，***P<0.001图1 不同浓度马卡列丙提取物处理MC3T3-E1细胞24 h对细胞活力的影响

2.2 马卡列丙提取物对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响 用分化培养液对成骨细胞MC3T3-E1进行药物处理，分化过程中细胞的形态会发生变化，细胞由扁平变成梭形。碱性磷酸酶是成骨细胞进行分化程度的指标，在早期骨形成中有重要作用。经过前期预实验发现分化6 d的碱性磷酸酶水平比较高，故分别用不同的提取物进行诱导分化筛选碱性磷酸酶活性比较高的提取物成分，主要筛选25 μg/mL 和50 μg/mL两个药物浓度。与溶剂对照组DMSO相比,25 μg/mL时大部分提取物没有诱导碱性磷酸酶的上升，只有剩余水提物(Ⅱ)的ALP水平上升并有显著性差异(P<0.001)。在50 μg/mL药物诱导时，乙酸乙酯部位(Ⅴ)和粗多糖(Ⅷ)具有较好的碱性磷酸酶活性，剩余水提物(Ⅱ)、醇提物(Ⅲ)、石油醚部位(Ⅳ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ)的碱性磷酸酶活性与阳性对照地塞米松(DEX)的作用相似，有上升的趋势。如图2所示。

注：与溶剂对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图2 马卡列丙提取物诱导MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性

2.3 马卡列丙提取物对成骨细胞矿化钙盐沉积的影响 用分化培养液加不同的提取物进行诱导，每3天重新更换药物进行处理，诱导分化10 d左右开始形成矿化结节，细胞成铺路石样的形态，并且有黑色的颗粒物在细胞表面形成。诱导至第14天，矿化结节比较明显，进行茜素红染色呈橘红色颗粒，橘红色的颗粒物的多少体现矿化程度。在低浓度25 μg/mL进行诱导矿化效果比较好，阳性对照地塞米松(DEX)、乙酸乙酯部位(Ⅴ)、正丁醇部位(Ⅵ)和水部位(Ⅶ) 矿化结节比较明显(图3A)。对矿化结果进行量化评价，阳性对照DEX和乙酸乙酯部位(Ⅴ)具有显著性差异，此外醇提物(Ⅲ)、正丁醇部位(Ⅵ)、水部位(Ⅶ)和粗多糖(Ⅷ)钙盐沉积有增多的趋势(图3B)。

注：与阳性对照组比较，*P<0.05。图3 马卡列丙提取物低浓度诱导MC3T3-E1细胞矿化效果

高浓度50 μg/mL进行诱导矿化的时候，在25 μg/mL有矿化效果的提取物的作用大部分下降了。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)表现出较强的矿化效果，有明显的矿化结节，在量化评价的时候有显著性差异(图4)。

注：A.矿化的形态图；B.矿化的量化图；*P<0.05，**P<0.01。图4 马卡列丙提取物高浓度诱导MC3T3-E1细胞矿化效果

2.4 马卡列丙提取物促进成骨细胞骨形成过程的活性筛选结果 马卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)对成骨细胞增殖、分化、矿化都有促进作用，醇提物(Ⅲ)和正丁醇部位(Ⅵ)促进增殖比较明显，但是分化和钙化活性不明显。剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)虽然不能促进成骨细胞增殖，但是具有明显的分化和矿化活性。此外，水部位(Ⅶ)有分化和矿化的趋势，石油醚部位(Ⅳ)在低浓度有微弱的钙化趋势(表1)。

表1 马卡列丙提取物活性筛选比较汇总

3 讨论

实验主要评价了马卡列丙提取物对小鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的影响。结果表明马卡列丙提取物有些部分含有促进成骨细胞增殖、分化和矿化的有效成分，其中乙酸乙酯部位(Ⅴ)效果最为明显，在增殖、分化和矿化过程中都明显高于阴性对照，与阳性对照组DEX相似。此外，剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)在分化和矿化作用评价时具有比较好的活性，但增殖活性较弱。促进增殖时有较好活性的醇提取物(Ⅲ)和正丁醇(Ⅵ)在分化和矿化的活性筛选较弱。实验结果表明虽然有些提取物成分没有对成骨细胞的增殖、分化和矿化都具有活性，但是在成骨细胞骨形成过程的其中1～2个阶段发挥作用。中药在促进骨折愈合的作用是多方面的，侗药马卡列丙有多个组分对跌打损伤和促进骨折愈合产生作用。综上所述，侗药马卡列丙对跌打损伤和促进骨折愈合具有促进作用的有效成分主要集中在乙酸乙酯(Ⅴ)部位，但是正丁醇(Ⅵ)、剩余水提物(Ⅱ)和粗多糖(Ⅷ)等提取物中也含有一些可以促进骨形成的化合物。要明确其促进成骨细胞增殖、分化和矿化的化合物成分，还需要进一步分离纯化和药物活性筛选。

实验发现侗药马卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)对体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化具有一定的促进作用，为该药用于治疗骨折及骨质疏松症提供了初步的药效学研究基础。为马卡列丙药材的进一步提取分离和开发提供了一定的实验依据。但是提取物成分复杂，不能完全排除非特异性物质对活性的干扰，因此进一步实验将利用大鼠胫骨骨折动物模型进行整体动物实验，检测骨折愈合过程中马卡列丙提取物乙酸乙酯部位(Ⅴ)促进骨折愈合的体内作用；并对乙酸乙酯部位的化学成分进行提取分离和鉴定，明确促进骨形成的化学成分。