精液优化处理后正常形态精子百分率对体外受精 胚胎结局的影响

李 赟， 尹 萍， 张武文， 李 凯， 童国庆

（上海中医药大学附属曙光医院生殖医学中心，上海 201203）

近年来，全球借助辅助生殖技术助孕的患者持续增多[1]。体外受精（in vitro fertilization，IVF）是目前治疗不孕症的主要方法。精子形态是精液参数的重要指标之一，其对胚胎发育的影响尚有不确定性[2-3]。本研究筛选了上海中医药大学附属曙光医院生殖医学中心因女方输卵管因素行IVF的患者，收集取卵当日优化处理后的精液，通过分析正常形态精子百分率对胚胎发育的影响，探索可以改善IVF临床治疗结局的理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2019年6月—2020年12月上海中医药大学附属曙光医院生殖医学中心行IVF的患者255例。入组标准：（1）单纯因输卵管因素导致不孕；（2）女方年龄≤35岁；（3）术前体检中未发现异常指标；（4）获卵数≥3个；（5）男方年龄≤45岁；（6）男科门诊生育力检查未发现器质性疾病。取卵当日对经优化处理的精液进行精子形态学分析，正常形态精子百分率均高于临床正常值（≥4%），符合最佳IVF授精要求。以正常形态精子百分率均值为分界点分为A组（正常形态精子百分率≤19.03%，128例）和B组（正常形态精子百分率＞19.03%，127例）。本研究纳入标本的正常形态精子百分率情况见表1。

表1 正常形态精子百分率

1.2 精液样本采集

男方禁欲2～7 d，采集精液前排尿，并用肥皂清洁以减少标本污染，使用手淫法在专用取精室收集精液标本，置于37 ℃培养箱中温育30 min后观察1次，然后10 min观察1次，总时长不超过1 h，待完全液化后行精液优化 处理。

1.3 精液优化处理

采用密度梯度离心法进行精液优化处理：在15 mL的专用离心管中加入1～2 mL 80%浓度的梯度液，在其上方缓慢地加入相应体积的40%浓度梯度液，沿管壁加入2～4 mL精液，使其形成明显分界线后，300×g离心20 min，弃上清液，用相同体积培养液混匀、沉淀；取5 μL优化处理的精液，加入10 μm厚Marker精子计数板（以色列Sefi Medical Instruments公司）腔室，计算精子密度，并将其调整至前向运动精子总数＞10×106/mL；留取适量精液推片，用于精子形态分析；其余精液待后续IVF加精使用。

1.4 精子形态分析

采用新型改良巴氏染色法（珠海贝索生物技术有限公司）对精液涂片进行染色分析。（1）将精液涂片放入95%乙醇固定不少于 15 min；（2）依次浸入80%、50%乙醇各30 s后缓水洗干净；（3）放入苏木精染液染色3～ 5 min后，水洗12 min；（4）酸性乙醇（70%乙醇200 mL加入1 mL浓盐酸）溶液浸1～4次；（5）缓水冲洗回蓝，平衡5 min后，依次放置于50%、80%乙醇30 s，再用6.95%乙醇脱水 2 min；（6）浸入改良巴氏染色液2～5 min，沥净；（7）用95%乙醇洗2次，每次10～20 s；（8）用无水乙醇脱水30 s，取出，待风干后行显微镜镜检。读片人员为2位取得世界卫生组织人类精液与处理实验手册培训证书者。评判标准参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》[4]中的精子形态学标准，在油镜下分析精子头部的顶体、细胞核、颈部和中段、主段的形态；每次连续计数完全镜下视野精子数不少于200条；2次计数核准需符合95%可信区间范围，计算每份标本2次计数的均值。

1.5 IVF

采用3037受精皿进行IVF，每个3037受精皿中加入卵母细胞≤15个。加精后，将培养皿放置于37 ℃、6%CO2培养箱中培养。受精 1 6～1 8 h后观察受精情况。以卵细胞原核（pronucleus，PN）≥1为受精，记录受精情况，其中2PN为正常受精。取卵72 h后再次观察，记录胚胎细胞数和细胞内的碎片情况。按胚胎实验室标准操作规程（standard operation procedure，SOP）观察胚胎等级，执行标准分为4个等级：（1）Ⅰ级为卵裂球大小均匀，形态规则，透明带完整，细胞质均匀、清晰，无颗粒，碎片率为0%～5%；（2）Ⅱ级为卵裂球大小略不均匀，形态较不规则，细胞质内有颗粒，碎片率为6%～20%；（3）Ⅲ级为卵裂球大小明显不均匀，有明显的形态不规则，细胞质内有较多颗粒，碎片率为21%～50%；（4）Ⅳ级为卵裂球大小严重不均匀，细胞质内有非常多的颗粒，碎片率＞50%。6个细胞，Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎；≥6个细胞，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎为有效胚胎。

1.6 主要观察指标

主要观察指标包括受精率（受精数/取卵数×100%）、异常受精率（异常受精数/受精数× 100%）、卵裂率（卵裂数/受精数×100%）、优质胚胎率（优质胚胎数/有效胚胎数×100%）、有效胚胎率（有效胚胎数/卵裂数×100%）。

1.7 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，非正态分布的计量资料以中位数（M）[四分位数P25～P75）]表示，组间比较采用Z检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A组与B组基本资料比较

A组与B组基本资料差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 2个组胚胎相关指标比较

B组有效胚胎率显著高于A组（P=0.038）；受精率、卵裂率、异常受精率和优质胚胎率2个组差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 A组与B组基本资料比较

表3 精液优化处理后正常形态精子百分率与胚胎相关参数的关系

3 讨论

随着我国生育政策的放开，居民生育需求大幅增加，但其中有10%～15%的有生育意愿的夫妇患有不孕不育症[5]，使得我国辅助生殖总周期数一直呈上升的趋势。精子对卵子的激活是IVF技术的关键步骤[6]，精子形态是重要的精子基础参数，直接影响精子的功能[7-8]。正常形态精子百分率对胚胎发育的影响目前尚不明确。有研究结果显示，正常形态精子百分率不影响胚胎发育[9-10]；但也有学者采用世界卫生组织精液分析评判标准[4]，发现正常精子形态会影响IVF的胚胎发育[11-13]；但这些研究均未提及精液标本是否收集于IVF取卵当日。由于男性精液质量有一定的波动性，所以本研究严格筛选了单纯因女方输卵管因素行IVF的非高龄女性，男方未见器质性异常，且获卵数≥3个的IVF周期。收集取卵当日获取的新鲜精液，并进行优化处理，使前向精子总数＞10×106/mL。 由于无法将评估后的精子再用于IVF，多数胚胎实验室SOP未将精子形态作为IVF常规检测。本研究发现，优化处理后的正常形态精子百分率对胚胎发育过程中的受精率、卵裂率、异常受精率和优质胚胎率无影响（P＞0.05），但对有效胚胎率有显著影响（P=0.038），提示精子形态缺陷可能对胚胎的发育有负面影响。NIKOLOVA等[14]也证实了这一结论，他们对精子形态、活率以及DNA碎片与胚胎形态动力学及IVF临床妊娠结果的相关性进行了分析，发现精子缺陷（卷尾、头部缺陷和多重缺陷）不仅对胚胎形态动力学有影响，对临床妊娠率亦有显著影响。因此，IVF当日精子形态分析可作为临床结果的潜在预测因子[14]。正常形态精子百分率相对较低的患者，精子头部可能存在内部缺陷，而精子头部缺陷主要影响胚胎发育的最后阶段，精子中段缺陷与胚胎卵裂有关，尾部缺陷与胚胎的早期发育有关。已有研究证实了精子质量可能与精子的染色质区域组装分离是否存在异常、精子DNA的完整和凋亡[15-16]、精子是否存在于高浓度的活性氧（reactive oxygen species，ROS）环境有关[17]。 高浓度的ROS会对精子的DNA造成损伤，从而导致精子的DNA产生单链或双链断裂。基于相关研究的推测，本研究对精液进行了优化处理，去除不活动的死精子和精液中的白细胞，以及少量原始细胞，降低ROS水平，从而优化整体精液参数。有研究发现，精液优化处理可以显著提高精子正常形态百分率，优化精子质量[18]，降低ROS，减少精子的损伤，从而提高精卵结合后正常发育的可能性[19]，凸显了精液优化处理的重要性。本研究结果显示，高正常形态精子百分率可显著增加有效胚胎率，提示精液优化处理后，正常形态精子百分率可用于预测胚胎实验室中胚胎发育的结局。

综上所述，对因女方输卵管因素而导致不孕、男方在生育能力上不存在器质性异常的夫妇，建议在进入IVF治疗周期前，先行优化处理后的精子形态学检查，评估正常形态精子百分率的水平，相对较高的正常形态精子百分率有利于IVF时在胚胎培养过程中得到相对较好的胚胎结局；而对于即使在精液优化处理后，正常形态精子百分率仅高于参考区间的患者，建议先行早期男科临床治疗干预措施，以辅助提高精子形态质量，提高有效胚胎率，从而获得更好的胚胎结局，改善IVF治疗的结局。