江苏省麦田猪殃殃对苯磺隆的抗性水平及靶标抗性机理研究

王红春 陈俊敏 谷 涛 王 可 陶 园 娄远来

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)

猪殃殃为一年生或越年生茜草科杂草，是江苏、河南、山东、河北等地麦田主要的阔叶杂草[1-2]。磺酰脲类乙酰乳酸合酶(acetyllactate synthase，ALS)抑制剂型除草剂苯磺隆是麦田防除阔叶杂草的主导除草剂品种，在我国已连续使用苯磺隆30年以上[3-5]。目前，我国河南[6-9]、山东[6]、江苏[6-7,10]、安徽[6-7]等地均已发现抗苯磺隆的猪殃殃种群。2008年，彭学岗等[6]发现采自江苏徐州的猪殃殃种群对苯磺隆存在一定的抗药性。2016年，崔海兰等[7]发现苯磺隆或双氟磺草胺防效差的7个猪殃殃江苏种群均对苯磺隆产生了抗药性。2017年，王红春等[10]发现采自江苏省的20个猪殃殃种群中有12个种群对苯磺隆产生了明显的抗药性，10个种群对苄嘧磺隆有交互抗性，4个种群对二甲四氯钠敏感性明显下降，所有种群对氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感。近年来，猪殃殃在江苏省麦田蔓延危害逐年加重的趋势明显，蔓延危害加重与其对主导除草剂的敏感性下降相关性及其具体原因仍有待系统研究，且缺乏针对性的猪殃殃治理措施。为此，本试验测定2020年采集于江苏省不同地区小麦田的猪殃殃种群对苯磺隆、苄嘧磺隆及氯氟吡氧乙酸、2甲4氯钠、唑草酮的敏感性，分析代表性种群ALS酶离体活性及其基因序列，旨在为制定江苏省麦田猪殃殃精准区域防控策略提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

2020年5月，于江苏省不同地区小麦田随机采集自然成熟的猪殃殃种子。田间采集时标记采集地点，装入牛皮纸袋，带回江苏省农业科学院植物保护研究所农田草害防控实验室，自然晾干后置于种子储存柜室温储藏。种群编号、采集地点等信息见表1。供试除草剂及其生产厂家如表2所示。

表1 猪殃殃种群采集地点信息Table 1 The collecting sites of Galium aparine seeds

表2 供试除草剂及其生产厂家Table 2 The herbicides and its production factories

苯磺隆剂量设计为11.25、22.5、45、90、180 g a.i.·hm-2。 其余除草剂处理剂量为其田间推荐有效成分用量的上限，即苄嘧磺隆75 g a.i.·hm-2、2甲4氯钠 1 147.5 g a.i.·hm-2、 氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、唑草酮36 g a.i.·hm-2。2甲4氯钠用蒸馏水溶解、稀释，唑草酮用甲苯溶解，苯磺隆、苄嘧磺隆和氯氟吡氧乙酸用丙酮溶解，用体积分数为0.1%的吐温80水溶液稀释。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料培养 供试土壤为马肝土，pH值6.7，有机质含量1.6%，风干过筛后备用。将长宽均为7 cm、高9 cm的白色塑料盆钵(底部具孔)装约3/4的风干细土，置于塑料周转箱内，底部加水使土壤水分饱和。分别播种经4℃低温蒸馏水浸泡7 d解除休眠的猪殃殃种子，每钵播种16粒种子，覆盖约0.5 cm厚度的细土，置于日光温室中培养(温度：白天20±5℃/晚上15±5℃，光照周期约12 h/12 h)。待杂草出苗整齐后，定苗至10株/钵。

1.2.2 猪殃殃种群对苯磺隆及其他除草剂的敏感性水平测定 于杂草2～3轮叶期，按照药剂设计剂量进行喷雾处理。喷雾采用3WPSH-500 D型生测喷雾塔(农业农村部南京农业机械化研究所)，圆盘直径50 cm，主轴转动速度6 r·min-1，喷头孔径0.3 mm，喷雾压力0.3 MPa，雾滴直径100 μm，喷头流量90 mL·min-1。 每个种群均设置不用药的空白对照，每处理4次重复。用水量为450 L·hm-2。处理后21 d，测定猪殃殃植株地上部分鲜重，计算鲜重抑制率，DPS统计分析软件通过线性回归方程(y=a+bx)计算猪殃殃植株地上部分鲜重被抑制50%时的除草剂剂量(GR50值)。式中，y为概率单位，a为截距，b为回归系数，x为以10为底的除草剂剂量对数值。相对抗性倍数(relative resistance index，RI)=抗性种群GR50/敏感种群GR50。

1.2.3 猪殃殃种群ALS离体活性测定 参考Ray[11]和邓维[12]的方法，剪取2～3轮叶期的猪殃殃地上部分5 g，经提取、纯化、脱盐后制备酶液，每处理重复3次。在1.5 mL离心管中加入不同浓度的苯磺隆溶液100 μL、酶液100 μL，涡旋混匀在37℃水浴锅中暗反应30 min后，加入20 μL 3 mol·L-1H2SO4终止反应，并将离心管转移到60℃水浴锅中保温15 min进行脱羧，再依次加入190 μL 0.5%肌酸和190 μL 5% 1-萘酚，60℃水浴保温15 min显色，4 000 r·min-1离心3 min，取200 μL上清液加至96孔酶标板中，测定530 nm处的吸光值。纯化的乙偶姻经梯度稀释后，制作以乙偶姻各稀释浓度为横坐标，OD530值为纵坐标的标准曲线，将最终测得的反应液OD530值代入方程求出反应液中乙偶姻含量。乙酰乳酸合酶对苯磺隆敏感性通过Sigmaplot 12.0软件非线性回归方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]计算ALS活性被抑制50%时的苯磺隆浓度(I50值)。式中，x表示除草剂的浓度，y表示每个处理的乙酰乳酸合酶催化活性，C代表最低值，D代表最大值，b表示在I50处的斜率。相对抗性系数(relative resistance index，RI)=抗性种群I50/敏感种群I50。

1.2.4 猪殃殃种群ALS基因突变分析 根据猪殃殃ALS基因序列(GU377313)设计引物(表3)，扩增片段包含目前已报道所有抗性相关位点。参照1.2.1的方法和1.2.2的结果，剪取供试猪殃殃植株的单株叶片，利用TRIzol试剂[货号10296010，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]提取总RNA，具体提取方法参照产品说明书；采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒[RR047A，宝生物工程 (大连) 有限公司生产]反转录cDNA，反转录方法参照试剂盒相关流程进行。每种群各10株提取样本，每个样本挑取8个经过PCR法确认的阳性克隆，交由上海生工生物工程公司进行测序。测序获得的序列与拟南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN软件比对分析。

表3 引物序列Table 3 Primers and sequences for PCR amplification

2 结果与分析

2.1 猪殃殃种群对苯磺隆的抗性水平

28个猪殃殃种群中，23个种群对苯磺隆产生了2.18～17.10倍的相对抗性(表4)。将江苏省的长江以南地区定为苏南地区，长江至苏北灌溉总渠地区为苏中地区，苏北灌溉总渠以北为苏北地区。江苏省不同地理种群的抗性分布结果表明，苏南地区10个猪殃殃种群中有8个种群对猪殃殃产生了5.84～14.96倍抗性，抗性种群比例为80%；苏中地区11个种群中有9个种群对苯磺隆产生了2.18～17.10倍抗性，抗性种群比例为82%；苏北地区7个种群中有6个种群对苯磺隆产生了抗性，相对抗性倍数为2.48～7.10倍，抗性种群比例为86%。

表4 不同地区猪殃殃种群对苯磺隆的敏感性Table 4 The sensitivity of different populations of G. aparine to tribenuron-methyl

2.2 猪殃殃抗性种群的交互抗性和多抗性

经磺酰脲类ALS抑制剂型除草剂苄嘧磺隆 75 g a.i.·hm-2处理，WJQ-3、LYM-1、TXS-1、YC-1、YC-2、HA-5、DHX-1、DHX-2种群地上部分鲜重抑制率均在96%以上，JYS-1、JYS-2、JYS-3等18个种群的鲜重抑制率均低于80%(表5)。经苄嘧磺隆75 g a.i.·hm-2处理，猪殃殃鲜重抑制率低于50%的13个种群中，苏北地区种群有4个(占苏北种群总数的57%)，苏中地区有5个(占苏中种群总数的45%)，苏南地区有4个(占苏南种群总数的40%)。

表5 不同除草剂处理后猪殃殃种群的地上部分鲜重抑制率Table 5 The fresh weight inhibition of different populations of G. aparine by different herbicides treatment /%

经苯氧乙酸类激素型除草剂2甲4氯钠1 147.5 g a.i.·hm-2、 吡啶氧羧酸类激素型除草剂氯氟吡氧乙酸210 g a.i.·hm-2、三唑啉酮类原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂唑草酮36 g a.i.·hm-2处理，采自江苏省的28个猪殃殃种群的鲜重抑制率均高于97%。

2.3 猪殃殃抗性种群的ALS酶活性和基因突变分析

选取LHQ-2(相对抗性系数17.10)、JYS-1(相对抗性系数14.96)、WJQ-2(相对抗性系数10.39)、RGS-1(相对抗性系数8.82)、RGS-3(相对抗性系数5.00)、DHX-2(相对敏感种群，相对抗性系数1.00)为代表性种群，测定其ALS酶对苯磺隆的离体活性。苯磺隆对敏感种群DHX-2 ALS酶的I50值为0.033 3 μmol·L-1，相对抗性种群LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1、RGS-3的I50值分别为9.034 0、8.457 1、1.380 3、0.508 5、0.051 7 μmol·L-1。其中，LHQ-2、JYS-1的相对抗性倍数均高于250倍(表6)。

表6 不同猪殃殃种群ALS活性及苯磺隆的I50值Table 6 Determination of the ALS activity and I50 values inhibited by tribenuron-methyl of different populations of G. aparine

对比拟南芥基因序列及敏感猪殃殃种群的ALS基因序列，LHQ-2和JYS-1种群在第197位由脯氨酸(CCC)突变为苏氨酸(ACC)，WJQ-2种群在第376位由天冬氨酸(GAT)突变为甘氨酸(GAA)，RGS-1种群在第574位由色氨酸(TGG)突变为亮氨酸(TTG)，而RGS-3、DHX-2种群未发现基因突变(表7)。

表7 不同猪殃殃种群ALS基因突变位点情况Table 7 The mutation sites of ALS gene in different populations of G. aparine

3 讨论

近年来，我国多地麦田猪殃殃种群对ALS抑制剂类除草剂苯磺隆产生了明显的抗药性。自2008年彭学岗等[6]发现采自江苏徐州的猪殃殃种群对苯磺隆产生抗药性以来，河南、安徽、山东、江苏等省陆续发现了抗苯磺隆的猪殃殃种群[7-9]。2016年采集于江苏省的20个猪殃殃种群中有12个种群对苯磺隆具有抗药性，10个种群对苄嘧磺隆有明显的交互抗性，4个高抗种群对2甲4氯钠敏感性下降，所有种群对氯氟吡氧乙酸和唑草酮敏感[10]。本研究发现，2020年的28个猪殃殃种群中，23个种群对苯磺隆产生了2.18～17.10倍的抗性，18个种群对苄嘧磺隆的敏感性明显下降，所有种群对2甲4氯钠、氯氟吡氧乙酸、唑草酮均敏感。2016年江苏省抗苯磺隆的猪殃殃比例为60%[10]，2020年抗性猪殃殃种群比例提高至85%，抗性比例增加了25个百分点，这可能与磺酰脲类除草剂在麦田中持续高强度使用有关。抗苯磺隆的猪殃殃种群比例呈现从苏南到苏北逐渐增加的趋势，可能由于苏北地区使用苯磺隆和苄嘧磺隆的频度高，而苏南地区使用的频度低有关，该趋势与2016年的研究结果相似。

高新菊等[9]研究发现，对苯磺隆具有53.92倍及以上抗性倍数的河南省麦田猪殃殃种群ALS基因氨基酸发生了突变。本研究发现，相对抗性倍数达到8倍以上的LHQ-2、JYS-1、WJQ-2和RGS-1猪殃殃种群的ALS氨基酸也发生了突变。其中，LHQ-2和JYS-1种群在第197位由脯氨酸突变为苏氨酸，该突变与抗双氟磺草胺的播娘蒿ALS突变情况相同[13-14]，而抗苯磺隆的牛繁缕、新疆白芥第197位由脯氨酸突变为丙氨酸[4,15]、抗苯磺隆的播娘蒿和抗苄嘧磺隆的丁香蓼和异型莎草第197位由脯氨酸突变为丝氨酸[5,16-17]；WJQ-2种群在第376位由天冬氨酸(GAT)突变为甘氨酸(GAA)，与抗苯磺隆的新疆白芥和抗ALS抑制剂的野慈姑突变情况相同[15,18]。第574位色氨酸突变为亮氨酸导致RGS-1种群产生了抗药性，该突变与抗苯磺隆的光果猪殃殃希腊北部种群的突变情况相同[19]，且与抗双氟磺草胺、苯磺隆的播娘蒿[5,13-14]及抗ALS抑制剂的麦家公[20]和萝卜[21]、抗苄嘧磺隆的异型莎草[17]ALS突变情况也相同，而孙健等[22]发现山东济宁市的猪殃殃种群第574位色氨酸突变为甘氨酸。本研究发现，江苏省麦田猪殃殃抗性种群ALS氨基酸有3个位点发生了突变，该发现与抗ALS抑制剂的新疆白芥[15]、播娘蒿[23]、长芒苋[24]、皱果荠[25]、Persicariapensylvanica(L.) M. Gomez[26]相似，均在一种杂草中发现了多种抗性突变类型。江苏省发现ALS基因不同位点氨基酸发生突变的猪殃殃种群，给抗性猪殃殃的治理和预防提出了新的挑战。

靶标酶基因突变是杂草抗药性产生的关键因素。交替使用作用机理不同的除草剂品种是延缓和治理杂草抗药性的主要方法[27-30]。本研究发现江苏省多地猪殃殃种群对磺酰脲类ALS抑制剂型除草剂苯磺隆和苄嘧磺隆产生了明显抗性，但所有种群对苯氧乙酸类激素型除草剂2甲4氯钠、吡啶氧羧酸类激素型除草剂氯氟吡氧乙酸和三唑啉酮类原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂唑草酮敏感。基于本研究结果，在防除江苏省麦田猪殃殃时，应尽量不用或少用苯磺隆和苄嘧磺隆，合理轮换使用2甲4氯钠、氯氟吡氧乙酸或唑草酮，以便控制抗性猪殃殃种群的产生和蔓延。

4 结论

采集于江苏省的28个猪殃殃种群中，23个种群对苯磺隆产生了2.18～17.10倍的抗性，18个种群对苄嘧磺隆的敏感性明显下降，所有种群对2甲4氯钠、氯氟吡氧乙酸、唑草酮敏感。LHQ-2、JYS-1、WJQ-2、RGS-1种群对苯磺隆的相对抗性达8倍以上，其ALS酶离体活性是敏感种群DHX-2的15倍以上，LHQ-2、JYS-1种群ALS酶第197位由脯氨酸突变为苏氨酸，WJQ-2种群的ALS酶第376位由天冬氨酸突变为甘氨酸，RGS-1种群的ALS酶第574位由色氨酸突变为亮氨酸。靶标酶活性提升和基因突变介导的靶标抗性是猪殃殃抗苯磺隆的关键因素。