高效重质石油降解菌群构建及降解性能评价

汪润民，张晓东，徐成华，于丹丹，余冉

（1 东南大学能源与环境学院，江苏 南京 211189；2 江苏省地质矿产局第一地质大队，江苏 南京 210041）

随着石化工业的发展，石油对水生和陆地环境的污染受到广泛关注。疏水性的石油烃在水面形成油膜，阻断大气与溶解性气体的交换，破坏水生生态系统。石油中的重质组分，如胶质、沥青质等会破坏土壤结构，分散土粒，降低土壤的透水性，改变土壤水分运动状况的同时，降低土壤有效磷、氮的含量。此外，环境中石油的积累会导致人体严重致癌、致畸和基因突变，并导致多种并发症。故石油污染治理一直受到高度关注。

石油污染场地的修复方法主要分为物理法、化学法和生物法。物理法主要包括拦截、吸附和萃取等。物理法具有回收率高的优点，但其处理成本过高，对环境的破坏不容忽视。化学法通过添加消油剂、凝油剂、表面活性剂等实现石油的乳化分解并结合化学氧化等技术手段实现石油污染物的完全去除。然而处理过程中使用的化学药剂会带来二次污染，对原生环境造成较严重的破坏。生物法主要是通过向污染区域添加石油降解菌剂或生物刺激剂，结合对目标场地环境条件的调控，利用微生物的代谢活动实现石油污染物的降解。近年来，生物法以其环境友好、成本低、高效等特点受到广泛关注。在国内，微生物修复技术在胜利油田、辽河油田和吉林油田污染场地进行的工程应用便累计处理超120kt 污染土壤，取得了巨大的经济和生态效益，故石油污染场地的微生物修复技术具有良好的修复效果及应用前景。

石油由饱和烃、芳香烃、胶质、沥青质四种组分构成。重质石油（以下简称重油）是相对密度大于0.9 的石油，其中的胶质和沥青质含量较高，造成重油黏度大且降解困难。传统石油污染场地修复相关研究中研发的生物菌剂一般为高效石油降解单菌，或是单菌复配的混合菌群；目标污染物大多为汽油、柴油或芳烃等分子量相对较小的污染物。Lucia 等在墨西哥湾的含油污泥中筛得菌株sp.对原油中的芳烃馏分具有明显的降解作用。张小梅等从大庆油田的含油污泥中筛选出一株既分泌表面活性物质又能降解总石油烃的菌株，可降解油泥中约70%的总石油烃。然而，基于石油成分的复杂性，单一菌株对污染物质生物降解难易程度差别大、生物降解路径很难明确，并可能产生具有环境毒性的中间产物；此外不同的细菌生长的最适温度、pH、盐度、对石油的各个组分的毒性耐受性等均存在一定差异。与单一细菌相比，混合菌群因为其催化酶的多样性。可对难降解成分实现协同降解。此外，混合菌群还可以在不断变化的环境中保持高效的生物降解能力。故获得可广谱降解所含石油组分及其降解中间产物的高效石油降解混合菌剂尤为重要。目前，已有研究者开展了关于未经纯化的混合菌群的效果研究，如Duc 等通过将假单胞菌和葡萄球菌混合培养，实现对硫丹的厌氧降解，效率从20%提升到34%。Zhao等证实混合菌群中微生物的协同作用可以增强混合菌群的稳定性和耐受性，提升高pH 污泥脱硫性能。Li等研究发现，真菌和污染土壤中菌群的协同代谢可以明显提高土壤中萘的降解效率。左丽敏等在江汉油田石油污染土壤中驯化出了以石油为唯一碳源的微生物混合菌群，并在35 天内降解了30%的石油。但有关混合菌剂对不同石油组分尤其是重油组分的降解潜力以及降解过程中混合菌剂的优势功能菌组成变化规律的相关研究仍相对缺乏。本研究通过构建重油降解高效混菌，根据降解不同时段的菌群结构变化，从而确定降解过程不同阶段的主要功能菌属；同时通过降解前后石油组分内结构和官能团的变化，评价混合菌群的降解性能。

1 实验试剂及方法

1.1 实验样品及培养基

降解实验所用菌种来源于实验室前期已驯化完成的石油降解混合菌群SD、GS、JS（实验室前期从源于山东东营、江苏徐州及甘肃重油污染土壤驯化而来的混合菌群）及本次从青岛某油井污染土壤中驯化得到的混合菌群QD；实验用石油来自江苏某油田，胶质与沥青质总质量分数约为30%，相对密度0.91，属重油。

试验用菌群富集培养基（MM1）：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1.5g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油2%、pH 6.5～7、微量元素液1mL/L ；石油降解试验培养基：MgSO·7HO 0.5g/L、KHPO1g/L、KHPO2g/L、NHCl 1.2g/L，石油0.5%、pH 7～7.5、微量元素液（组成为CaCl2g/L、FeSO1g/L、CuSO1g/L、 ZnSO0.05g/L、 MnSO0.05g/L）1mL/L。

1.2 实验方法

1.2.1 QD/QM高效重油降解混菌的驯化培养

称取20g 污染土壤于30mL 富集培养基，于30℃、150r/min 下混合培养50 天，每隔7～10 天补充20mL 富集培养基。静置取50mL 上层菌液，在8000r/min 下离心5min，去除上清液，用相同体积的无菌PBS重悬后4℃保存。QM混合菌群由四种混菌菌液（OD=0.6）以体积比为1∶1∶1∶1 混合后，量取5mL 加入100mL 灭菌MM1 培养基中，在30℃、150r/min 条件下进行2～3 个周期，每个周期50～60天的恒温驯化培养。

1.2.2 重油降解试验搭建

分别向2 组100mL 的灭菌MM1 培养基中加入5%OD=0.6的QD混菌或QM混菌菌液，以无菌培养液为空白组，30℃、150r/min恒温培养，每隔5～8 天平行取3 个样品检测石油降解率。石油降解率测定方法采用GB/T 5750.7—2006《水中石油类物质检测方法——重量法》进行检测。

1.2.3 石油族组分层析分析

石油中包含四类组分：饱和烃（饱和分）、芳香烃（芳香分）、胶质和沥青质。将重量法测定后的石油样品用于族组分层析实验，层析实验方法参照SY/T 5119—2016《岩石中可溶有机物及原油族组分分析》。试样中各族组分质量分数按照式(1)计算。

式中，为称量瓶+族组分+空白值的质量，g；为称量瓶质量，g；为空白值，g；为试样质量，g；X分别表示饱和烃、芳烃、胶质和沥青质的质量分数。

1.3 红外光谱分析

使用Nicolet iS10 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo fisher）进行石油组分红外光谱分析。通过压片法制备直径为13mm、厚度为1mm的固体试样透明薄片，置于夹持器中；将夹持器放入仪器的试样吸收池位置，起始透光率＞20%时，即可进行测量；通过谱图中的特征峰及振动变化确定石油中的特征组分及结构的变化。

1.4 菌群分析鉴定

使用E.Z.N.A.soil DNA kit （Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.） 进行样品总DNA 抽提，使用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取质量，使用NanoDrop2000 测定DNA 浓度和纯度；使 用 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 对16S rRNA 基因V3-V4 可变区进行PCR 扩增，每个样本3 个重复；利用Illumina 公司的NovaSeq PE250平台进行测序。

使用fastp（version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH（version 1.2.7）软件进行拼接：使用UPARSE软件（version 7.1），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier（version 2.2）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA 数据库（version 138），设置比对阈值为70%。

2 结果与讨论

2.1 混合菌群的筛选及鉴定

从青岛某油井污染土壤中富集获得菌群QD 并进行了长达半年的以重油为唯一碳源的连续强化驯化，并将强化后的QD菌群与前期所获JS、SD、GS标准富集菌液（OD=0.6）以体积比1∶1∶1∶1的比例混合（本文只研究等比例复配条件下的重油降解，有关混合比例对重油降解的影响有待后续研究），得到混合菌群QM。QM混合菌群生长周期约为14 天，培养12～14 天时生物量可达到最大值，约为4×10CFU/mL，如图1所示。

图1 QM菌密度与OD600值线性关系标准曲线与其生长曲线

在重油降解过程中，分别在不同阶段对QM混合菌群进行采样分析，降解实验前期（10天）、中期（30天）及后期（50天）。混合菌群的多样性指数如表1所示。在重油降解实验的整个过程中，混合菌群的多样性及均一性水平总体稳定。随着降解时间的延长，菌群ace 指数与chao 指数逐渐增大，表明随着降解实验的进行，混合菌群丰度不断增大。生物降解各阶段优势菌属如表2所示，优势菌属相对及绝对丰度差异如图2(a)、(b)所示。在重油生物降解前期，占主导地位的菌属为、、等；而随着反应时间的延长，及属细菌的丰度逐渐升高。在石油降解及石油污染土壤生物修复的过程中均被证实可起到重要作用，尤其在汽柴油污染土壤中其丰度优势明显；对石油中的重质或难降解组分具有长期缓慢的降解效用；具有较强的耐受石油污染的能力，而可产生表面活性剂，有助于石油，尤其是多环芳烃菲的降解。 综 合 推 测 ，及属的细菌在石油重质组分及难降解组分的降解中或起主要作用。

图2 重油生物降解不同阶段QM降解菌群优势菌属丰度差异（前15种）

表1 QM混合菌群多样性指数

表2 重油生物降解各阶段优势菌属（＞5%）

2.2 混合菌群重油降解分析

分别使用连续强化驯化前后的QD 菌群及QM菌群开展重油降解研究。重油在降解过程初期附着于瓶底；随着时间的推移，部分石油以油滴的形式分散到菌液中，到40～50天后，菌液逐渐变成淡黄色，菌液中的油滴量明显逐渐变小。

强化驯化前后的QD 菌群及QM 菌群对重油石油50天的降解效率如图3所示。三种混菌均对试验用重油具有降解效果，重油降解率总体随反应时间延长而增加。在50天内，强化培养前的QD混合菌群仅能去除25.42%±2.12%的重油，强化后的QD混合菌群则可去除41.57%±1.08%的重油，而QM混合菌群在20 天内即可去除42.31%±3.51%的重油，50 天时可去除53.48%±2.89%的重油。表明强化连续驯化培养可以有效的提升混合菌群的重油降解效果，而进行菌群复配后的混合菌群在进一步提升重油降解效果的基础上，还可以实现更加高效的重油降解。故推测连续培养过程同时也是混合菌群的定向驯化过程，促使菌群结构向有利于重油降解的方向进化。

图3 连续培养前后的QD混菌及四合一混合菌群（QM）的重油降解率

为了研究菌群对石油各族组分的降解，对强化后的QD 菌群及QM 混合菌群降解的石油样品进行族组分分析（图4）。结果显示，就轻质组分来说，50天时，强化QD菌群及QM菌群分别可实现46.93%、73.71%的饱和烃组分降解以及40.83%、53.17%的芳香烃组分降解。同时，对两种混合菌群的石油族不同组分的降解效率进行相关性分析（表3）发现，样品中饱和烃及芳香烃含量与时间均成显著负相关。QM 菌群及强化QD 菌群均能实现对轻质组分的有效降解，且QM菌群的降解效率及降解效果均明显优于强化QD菌群。

表3 降油菌群作用下各组分质量与时间的相关系数及50d降解率

图4 混合菌群对石油族不同组分随时间的降解情况

就难降解的重质组分来说，强化QD 混合菌群降解样品中胶质含量与时间成显著负相关，沥青质含量与时间无明显相关关系，而QM混合菌群降解样品中的结果恰恰相反。强化QD混合菌群可以实现对36.15%胶质的有效降解而不能实现对沥青质的有效降解，而QM 混合菌群可以实现对25.56%±5.40%的沥青质的有效降解而不能实现对胶质的有效降解。这可能是因为QM混合菌群在有限时间内仅将重质组分降解为结构更为简单的短链烃，对胶质、饱和烃和芳香烃组分进行了“补充”。

2.3 混合菌群重油降解性能评价

选取QM 混合菌群降解石油过程中0、30 天、50 天的样品进行层析和傅里叶红外光谱分析（图5）。结果显示，混合菌群在实现简单结构的降解之外，在难降解有机物的活化及轻量化过程中存在明显的积极作用。2930cm、2850cm为—CH—的伸缩振动吸收峰，460cm、1380cm为—CH—的面内弯曲振动吸收峰。在饱和烃降解过程中烷基吸收峰的高度降低，表明脂肪烃甲基、亚甲基的降解是重油降解的一种重要途径；在芳香烃、胶质和沥青质中烷基吸收峰的高度逐渐升高，且在降解中后期尤为明显，表明重油降解过程会导致芳香烃、胶质、沥青质的饱和度增大，直接表现为苯环的开环。1000～650cm的区域为C—H 面外弯曲振动区，为苯环取代基特征振动吸收峰。如图5(b)～(d)所示，芳香烃及胶质组分在重油降解过程中后期出现了明显的吸收峰，表明苯环上取代基增多，混合菌群对苯环大Π 键有活化作用。1260cm、1120cm及1080cm为酯基和醚基特征吸收峰。降解实验中后期芳香烃和胶质中出现了降解前仅存在于沥青质中的酯基和醚基的特征吸收峰，表明混合菌群可实现含酯基及醚基的多环缩合环化合物的部分降解。综上所述，除实现甲基、亚甲基等轻质基团的降解外，混合菌群还可能通过多环结构的开环、活化及酯基醚基等特征基团的轻量化等方式，提高难降解有机物的可降解性。

图5 重油样品红外谱图

3 结论

混合菌群的连续强化培养及混合菌群间的复配可显著提高其重油降解能力。混合菌群QM50天内重油降解率可达53.48%±2.89%，沥青质降解率可达25.56%±5.40%，成功实现单菌难以达到、高效且稳定的重油及重质组分的降解。混合菌群中起主要降油作用的优势菌属为、、、等且在降解过程不同阶段中存在明显差异， 其中、等菌属的细菌或对重质及难降解组分有着优良的降解性能。QM混合菌群降油过程中改变了重油，尤其是重油重质组分结构，使重质组分饱和度增大、多环结构活化，显著提升了重油的生物可降解性。