金黄疏肝应激散对靶动物草鱼的安全性试验

肖飞

（武汉华扬动物药业有限责任公司，武汉 430205）

鱼类抗应激能力是衡量鱼类健康水平的重要标志之一，而鱼类健康水平是依赖于机体诸器官的正常运转，其中肝胆功能与鱼体代谢密切相关。开发金黄疏肝应激散的目的是通过饲料中添加适量的药物，保护鱼体肝脏及解除机体内毒性物质的积累，促进机体正常代谢，以提高其抗应激能力。

该中药制剂对非病原性疾病的症状治疗针对性较强，主药郁金具行气化瘀、疏肝利胆、增强肝酶活性、降血脂、抗氧化等作用；姜黄作为平肝药，具改善肝胆实质细胞病损、利胆促代谢功能；辅药刺五加益气安神、抗应激、改善内分泌，具适应原样作用和对病理过程起调节作用。

为证明金黄疏肝应激散在推荐使用条件下对靶动物的安全性，了解草鱼与金黄疏肝应激散可能出现毒性有关的临床反应特征，确定金黄疏肝应激散对靶动物的安全范围，指导临床用药，有必要评价金黄疏肝应激散对靶动物草鱼的安全性。为此，本研究将从增重率［1，2］、血液学［3］和组织学等3方面来评价其安全性。

1 材料与方法

1.1 受试药品

金黄疏肝应激散（主要成分：郁金、姜黄、刺五加，批号为20200125），由武汉华扬动物药业有限责任公司提供。

1.2 试验动物及饲养管理

健康草 鱼360尾，尾重50˜70 g，试验 前，用50 mg/L高锰酸钾对水族箱、试验用具和水体进行彻底消毒，然后再彻底冲洗。先将受试鱼在室内2个大型水族箱（每个水箱水量1.5 m3）中暂养2周左右，水温为（28±2）℃，pH 6.8˜7.4，持续充氧，溶氧量5.0˜ 8.0 mg/L。保持恒定的水流，每天换水率约为30%，光照周期为12 L∶12 D。驯化期间每日于上午9点左右投喂1次颗粒饵料（其组成及成分见表1），投喂量为鱼体重的2%。受试鱼暂养后期活动正常，无病，无死亡，暂养结束后选择体质健壮、无病无伤的个体进行分组试验。试验箱为圆筒形水箱，水体积约为120 L。

表1日粮组成及营养成分

1.3 试验方法

暂养后试验鱼禁食24 h后，将试验鱼共分为4组进行养殖试验，分别为对照组和低剂量（L）、中剂量（M）、高剂量（H）试验组，每组3个重复箱，每箱30尾鱼。药物组剂量分别为100、300和500 mg/kg体重（推荐剂量为100 mg/kg体重），折算到饲料中添加分别为0.5%、1.5%和2.5%。将粉状试验药物掺入到粉状饲料中，并加入适量黏合剂，充分拌匀后，自配成颗粒状饲料，晾干，饲养3周，每周对每组鱼进行称重，依此调整投饵量。

1.4 指标测定

1.4.1 一般状况观察每天对鱼的摄食、呼吸、游动及外观状况进行观察。若出现明显中毒症状或死亡，对鱼进行剖检，观察脏器的病理变化［4］。养殖试验结束时，禁食24 h，称量鱼体总质量，计算各剂量组草鱼的增重率。增重率=100%×（末均重－初均重）/初均重。

1.4.2 血液生理生化指标随机捞取15尾鱼，用一次性注射器从尾静脉采血，分装于普通和加有抗凝剂的EDTA-K2采血管中，分别用于制备血清和全血。由于有的鱼个体不够大，或采血不够顺利，采集的血量有限，部分指标为2˜3尾鱼血样混合后测定的结果。

1.4.3 病理组织观察采血前测定试验鱼的体重。然后，取肝胰脏、肾脏和脾脏［5，6］放入Bouin’s液中固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，组织切片机切片，厚度为4˜5 μm，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察组织学特征。

1.5 数据统计分析

利用SPSS软件进行数据显著性检验。采用t检验比较试验组与对照组间均增重、血液学和血液生化学等各项指标的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 外观表现

与对照组比较，试验期间各给药组游动、集群、栖息水层、食性、外观均无异常变化。此外，各试验组在3周试验时间均未出现因病死亡，只有低剂量和高剂量试验组各1尾跳出鱼箱未及时发现而死。

2.2 各组草鱼特定生长率、饲料效率

试验期间，各组草鱼初均重、末均重、平均增长率见表2。与对照组相比，低剂量和中剂量试验组的平均增重率比对照组有所增加，但差异不显著（P＞0.05），高剂量试验组的增长率虽有所下降，但与对照组相比也没有显著差异（P＞0.05），表明投喂金黄疏肝应激散不影响鱼的摄食与生长，而且中低剂量甚至具有一定的促生长作用。

表2 试验各组草鱼的增长率（n=15）

2.3 血液生化指标变化

各试验组草鱼血液生理生化指标检测结果见表3。投喂常规剂量的金黄疏肝应激散3周对草鱼的健康没有产生影响，肝肾功能和血球蛋白含量都未受影响。与对照组相比，各试验组血清中总胆固醇含量均有下降，其中低剂量和中剂量试验组显著下降（P＜0.05）。此外，低剂量试验组AST、总胆红素水平明显低于对照组。高剂量试验组的白蛋白含量比对照组有显著下降（P＜0.05），总蛋白含量也有一定程度下降，但差异不显著（P＞0.05）。

表3 各组草鱼血液生理指标情况（n=15）

2.4 金黄疏肝应激散对草鱼组织病理学影响

2.4.1 肝脏组织病理变化对照组在试验过程中形态结构变化不大［7，8］，清晰可见肝细胞以中央静脉为中心向四周排列呈索状，肝细胞呈多边形，边缘清晰，核清晰可见，基本位于中央，肝细胞索之间有窦状隙。金黄疏肝应激散不同添加量试验组的草鱼肝脏组织均未发生明显病理变化（图1），与对照组基本相似。

图1 对照组和试验组草鱼肝脏的组织学切片

2.4.2 肾脏组织病理变化对照组草鱼肾脏组织无明显病理变化，肾小体颈段由单层立方上皮构成，细胞呈矮棱柱状，细胞核为圆形，中位。近曲小管由单层柱状上皮细胞构成，细胞呈高棱柱状，细胞核大，基位，多为圆形或椭圆形，细胞间界限模糊。远曲小管由单层立方上皮细胞构成，细胞呈矮棱柱状，细胞核为圆形，中位，细胞间界限较为清晰。收集管连接肾单位与集合管，管道外有少量结缔组织，细胞呈立方形，细胞核中位（图2）。金黄疏肝应激散不同添加量试验组草鱼的肝脏组织均未发生明显病理变化。

图2 对照组和试验组草鱼肾脏的组织学切片

2.4.3 脾脏组织病理变化对照组肠道黏膜上皮细胞排列整齐，纹状缘发达，黏膜层杯状细胞较多，黏膜下层较薄（图3）。金黄疏肝应激散不同添加量试验组草鱼脾脏组织均未发现明显病理变化。

图3 对照组和试验组草鱼脾脏的组织学切片

3 讨论与结论

3.1 金黄疏肝应激散对草鱼增重率、血液生理指标的影响

中草药作为饲料添加剂在鱼类应用的研究表明，姜黄和含有姜黄的复方中草药能较好地提高鱼类的生长性能。本研究发现采用含有郁金、姜黄和刺五加的中药复方制剂金黄疏肝应激散进行靶动物安全性试验，连续饲喂草鱼3周，各试验组均未发生因疾病而导致的死亡，表明不同剂量的金黄疏肝应激散不会影响鱼类的存活率，具有潜在的提高草鱼生产的趋势，与相关研究报道一致［9-12］。

ALT、AST是反映肝细胞线粒体和胞浆健康状况的重要转氨酶，通常血液中含量较少。当肝脏受损伤时，会引起细胞通透性增加，转氨酶会转移到血液中。因此，血清中ALT、AST活性的高低可以反映肝功能的健康状况［13］。本研究中各试验组血液中的ALT和AST均没有影响，表明金黄疏肝应激散未对草鱼造成肝肾损伤。高剂量试验组的白蛋白含量低于对照组（P＜0.05），而且血红蛋白和血清总蛋白含量也略低于对照组，可能是由于添加的药物比例过高，降低了饵料中蛋白质含量。试验组的总胆固醇水平低于空白组，而且低剂量和中剂量试验组有显著差异（P＜0.05），说明金黄疏肝应激散有改善脂质代谢的作用，有利于防治肝胆综合征。

3.2 金黄疏肝应激散对草鱼组织病理学影响

研究表明，姜黄素的小鼠单次给药最大量为20 g/kg，SD大鼠重复给药最大无毒反应剂量（NOAEL）为4 g/kg［14］。陈娇娇等［15］研究发现姜黄素对斑马鱼胚胎及幼鱼有一定的急性毒性及致畸作用，作用于胚胎和幼鱼的最大安全浓度分别为1.86和4.0 μmol/L。本研究中未表现出金黄疏肝应激散对草鱼的毒性作用，可能与试验靶动物和剂量有关。徐道修［16］采用郁金散水煎剂进行了最大浓度、最大体积给小鼠一次性灌胃试验，试验过程中未发现小鼠有死亡的现象，表明郁金散水煎剂具有良好用药安全性。孙兰等［17］采用小鼠经口灌胃给予刺五加口服液，结果发现雌、雄小鼠经口急性毒性MTD均大于24.0 g/kg BW，属于无毒级；在2.5˜10.0 g/kg BW剂量范围内，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验结果未见异常，属于阴性，表明刺五加口服液无毒且未显示有遗传毒性。本研究设置对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组，其中对照组投喂正常日粮，试验组按剂量添加金黄疏肝应激散，通过长达21 d的连续投喂，即使高剂量金黄疏肝应激散也未导致试验鱼的肝功能异常，甚至还有降低转氨酶活性的作用。尿素氮和肌酐水平也都没有差异，说明即使高剂量金黄疏肝应激散也不影响肾功能。组织学切片也没有发现肝、肾和脾脏有明显的病变发生。试验组草鱼肝脏、肾脏和脾脏与对照组相比均无显著变化，表明金黄疏肝应激散在组织水平上对草鱼不存在明显毒性［18］。