九阡李果实发育期主要有机酸及氨基酸含量变化

崇慧影，潘绍佐，李冰晶，刘国华，王代波

（1.贵州省生物研究所，贵阳 550009；2.三都水族自治县九阡镇农业技术综合服务中心，贵州 黔南 558113）

九阡李（Prunus salicinaLindl.）为蔷薇科（Rosaceae）李亚科（Pnmoideae）李属（PrunusLinn.）李［1］，是贵州省独有的地方早熟优良李品种［2-4］，因产地九阡镇而得名［5］。其因果实色泽鲜艳［6］、风味独特［7］、早熟而闻名省内外［8］。地方政府于2000年开始重视九阡李种植产业的发展［9］，种植面积曾达933 hm2，后由于缺乏科学的育苗及栽培管理技术［10］，经济效益没有达到预期，面临低产低效问题，目前种植面积减至400 hm2。果实中的有机酸［11］及氨基酸是决定果实风味和品质的重要指标，它的组成类型、比例与果实酸味、口感密切相关［12］。有学者指出李属果实含有多种有机酸和氨基酸，多以苹果酸［13］、奎宁酸［14］、琥珀酸［15］中的1种或2种为主要有机酸［16］，氨基酸以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸［17，18］为主，但九阡李果实中有机酸及氨基酸在发育期的变化规律鲜见相关报道。笔者以九阡李为试验材料，研究其果实发育期有机酸及氨基酸的变化规律，旨在为今后九阡李果实品质及其风味的形成机制研究奠定基础，为科学栽培管理提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料取自九阡李产地贵州省三都县九阡镇水昔村山地果园10年生九阡李树，果园面积0.67 hm2，海拔660 m，随机选定3株果树，从树冠外围的东、南、西、北、中5个方位各选取形态和成熟度相近的果实5枚［19］，自幼果期3月10日开始采样到果实成熟，15 d采样1次，至果实成熟，共采样5次。1.1.2主要试剂有机酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；氨基酸混标标准品，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司（Sigma-Aldrich）；色谱级乙腈，德国默克公司；醋酸钠、三乙胺等试剂为分析纯。

1.1.3 仪器与设备TG-16G型台式高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；FA1204型电子天平，上海衡际科学仪器有限公司；CHA-2型气浴恒温摇床，苏州威尔实验用品公司；PS40A型超声清洗仪，深华泰科学仪器有限公司；高效液相色谱仪：美国Waters 2695，配置Waters2998检测器、安捷伦1260液相色谱串联AB4000型质谱仪、水浴氮吹仪，上海那艾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPLC法检测九阡李果实发育期有机酸的含量准确称取样品约1 g，加入4倍体积的0.2 mol/L偏磷酸溶液；冰水浴超声30 min，12 000 g离心5 min，取上清液，定容至5 mL；取1 mL提取液，过0.22 μm水相滤膜，待上机检测。

色谱条件：色谱柱为Polaris 180A C18-A（250.0mm×4.6 mm，5 μm）；流动相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为210 nm。

1.2.2 LC-MS法检测九阡李果实发育期氨基酸的含量准确称量0.5 g样品；加入0.001 mol/L HCl的20%乙 醇 溶 液3 mL；低 温 水 浴 超 声30 min，4℃12 000 g离心5 min，取上清液，沉淀加入1 mL提取液重新提取2次；合并3次上清液，定容至6 mL；吸取1 mL液体，过0.22 μm水相滤膜，置于-20℃冰箱待上机检测。

色谱条件：色谱柱为Polaris 180A C18-A（250mm×4.6 mm，5 μm）；流动相pH=2.8，0.5% NH4H2PO4水溶液，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL；检测波长为210 nm。

2 结果与分析

2.1 发育期主要有机酸的含量变化

2.1.1 发育期有机酸的检测分析采用HPLC法对九阡李果实样品进行有机酸检测，共检测出5种有机酸，分别是琥珀酸、奎宁酸、莽草酸、富马酸、苹果酸。在九阡李5个发育时期内，有机酸平均含量最高为奎宁酸，达93.56 μg/g，其次为琥珀酸，平均含量为44.61 μg/g。莽草酸、苹果酸、富马酸平均含量较低，分别为2.03、0.64、1.40 μg/g（表1）。从有机酸平均含量来看，奎宁酸占总有机酸含量的65.78%，琥珀酸占总有机酸含量的31.36%。从有机酸积累量来看，成熟期果实5种有机酸积累量含量高低表现为奎宁酸＞琥珀酸＞富马酸＞莽草酸＞苹果酸，奎宁酸占总有机酸含量的64.35%，琥珀酸占总有机酸含量的33.16%，含量明显高于富马酸、莽草酸、苹果酸，这3种有机酸仅占总有机酸含量的2.49%。

表1 有机酸含量测定

2.1.2 发育期主要有机酸的含量变化分析如图1所示，在九阡李果实发育初期到中期奎宁酸含量逐渐减少，发育后期奎宁酸含量急剧增高达到峰值，至成熟期其含量减少至发育初期含量水平，奎宁酸含量在果实发育期有明显变化，但成熟期奎宁酸含量与幼果期含量无明显变化。琥珀酸在九阡李果实发育期内含量变化整体呈先缓慢降低再缓慢升高再缓慢降低的趋势，与奎宁酸不同，琥珀酸在整个果实发育期虽有变化，但整体波动不大，同样在发育后期含量达到峰值（图2）。

图1 奎宁酸含量变化

图2 琥珀酸含量变化

2.2 发育期氨基酸的含量变化分析

九阡李发育过程中的氨基酸含量变化如表2所示，九阡李供试样品中共检测出22种氨基酸，包括8种必需氨基酸。这22种氨基酸在九阡李发育过程中呈5种变化趋势：同型半胱氨酸在九阡李果实整个发育期内含量基本没有变化，S-腺苷甲硫氨酸在发育期内含量呈先升后降的趋势，谷氨酸在发育期内呈升-降-升-降的变化趋势，缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸5种氨基酸在发育期内呈升-降-升的变化趋势，其余14种氨基酸呈升-降的变化趋势。22种氨基酸在九阡李整个发育期内，平均含量高低表现为天冬酰胺＞谷氨酰胺＞脯氨酸＞缬氨酸＞异亮氨酸＞丝氨酸＞γ-氨基丁酸＞天冬氨酸＞亮氨酸＞组氨酸＞谷氨酸＞丙氨酸＞色氨酸＞苏氨酸＞苯丙氨酸＞酪氨酸＞精氨酸＞赖氨酸＞甘氨酸＞S-腺苷甲硫氨酸＞甲硫氨酸＞同型半胱氨酸，其中，前8种氨基酸含量＞100 μg/g，中间11种氨基酸含量处于10˜100 μg/g，后3种氨基酸含量＜10 μg/g。天冬酰胺在整个发育周期内平均含量远高于其他21种氨基酸，平均含量达1 797.30 μg/g。九阡李成熟期氨基酸含量达100 μg/g以上的有天冬酰胺（641.62 μg/g）＞脯氨酸（396.62 μg/g）＞丝氨酸（151.86 μg/g）＞天冬氨酸（116.98 μg/g）＞缬氨酸（100.51 μg/g）。天冬酰胺、脯氨酸在总氨基酸中占比分别为33.69%、20.82%，为主要氨基酸。

表2 氨基酸含量测定 （单位：μg/g）

3 小结与讨论

果实有机酸组成与含量受基因控制［20］及果实发育的调控［21］，还与其他环境因子有关。李属果实大部分以苹果酸为主要有机酸，而在欧洲李（Prunus domesticaL.）果实中奎宁酸含量最高，本试验采用HPLC法在九阡李果实中检测出5种有机酸，其中奎宁酸、琥珀酸含量远高于其他3种有机酸，奎宁酸含量占总有机酸含量的64.35%，确定九阡李是以奎宁酸、琥珀酸为主要有机酸，这可能是导致九阡李相较于其他李品种具有独特风味的主要原因，例如贵州省优异李品种蜂糖李为苹果酸型。奎宁酸和琥珀酸含量总体都呈降-升-降的变化趋势，皆在果实发育后期达到峰值，成熟期有机酸含量降低是由于有机酸作为糖酵解、三羧酸循环（TCAC）及糖异生作用的基质被消耗［22］，有机酸在果实发育过程中是果实品质形成的基础物质和代谢能量保障［23］。通过LCMS法检测九阡李果实在发育期内的氨基酸含量，测出22种氨基酸，这些氨基酸在九阡李发育期内含量变化差异明显，共出现5种变化规律。其中，天冬酰胺、脯氨酸含量丰富，占总氨基酸含量的54.51%，证明九阡李区别于大多数以天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸为主要氨基酸的果树品种，天冬酰胺含量呈现出在果实发育前期快速增长，之后逐渐降低的变化趋势，这可能是因为果实发育中期受有机酸快速积累的影响。而脯氨酸也在发育前期迅速积累，发育中期急剧降低后又迅速积累至果实成熟。