不同衍生剂柱前衍生-HPLC-SPD二极管阵列测定特殊医学用途配方粉中牛磺酸含量

王亮亮，邱宇*，陈同强，荆辉华，王凯，言剑

（1.湖南省产商品质量检验研究院，湖南 长沙 410000；2.食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410000）

牛磺酸是一种含硫的β-氨基酸，是人体中重要的氨基酸之一，化学名为2-氨基乙基氨基酸[1]，分子式为C2H7NO3S，具有多种生理功能，如能促进大脑发育及损伤修复[1-2]，促进视觉机能[3]，提高免疫力[4]，调节神经传导[5]，还可用于感冒，具有抗炎症、抗氧化等功能[6-7]。

牛磺酸的检测方法有酸碱中和滴定法[8]、分光光度计法[9]、薄层色谱法[10]、超高效液相色谱法[11]，液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12]、氨基酸分析仪法[13]。近年来，从前处理方式的简易程度、结果的正确性及样品的稳定性考虑，高效液相色谱串联质谱法具有灵敏度更高、重现性更好、结果更准确等优势。但牛磺酸本身在SPD二极管下无光谱吸收，需进行衍生化处理，其衍生方式可分为柱前衍生和柱后衍生两种方式，柱前衍生的衍生剂主要有 2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）[14]、2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）[14]、丹磺酰氯（dansulfonyl chloride，Dansyl-Cl）[15]、异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）[16]、邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）[17]、荧光胺、2，3-萘基二缩醛（2，3-naphthyl dialdehyde，NDA）[14]等衍生剂；柱后衍生法主要以OPA作为衍生试剂[17]。目前国内外还未见有关于不同衍生剂衍生测定特殊医学用途配方粉中牛磺酸的效果比较分析，国家标准GB 5009.169—2016《食品安全国家标准食品中牛磺酸的测定》检测对象并不包括特殊医学用途配方粉，且因该类样品中营养物质多，产品基质和结构成分与普通食品有着较大的区别，牛磺酸的检测易受干扰，杂峰多，甚至会出现假阳性结果。本文通过优化检测条件，建立特殊医学用途配方粉柱前衍生-高效液相色谱-SPD二极管阵列检测法，从加标回收、试样检测及操作步骤等多角度比较分析DNFB、Dansyl-Cl、OPA3种不同衍生剂对牛磺酸测定的影响，为特殊医学用途配方粉的质量控制和监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：牛磺酸（taurine，Tau）（纯度≥99.9%，CAS：107-35-7，批号：CDAA-28007）：ANPEL 公司。

8种不同的特殊医学用途配方粉（浓缩乳清蛋白粉Esprion300、浓缩乳清蛋白粉TP800、特殊医学用途蛋白质组件配方粉、低乳糖配方粉、氨基酸代谢障碍配方粉、深度水解乳蛋白配方粉、母乳营养素配方粉、全营养配方粉）：市售。

亚铁氰化钾、乙酸锌、碳酸钠、乙酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2，4-二硝基氟苯：山东西亚化学工业有限公司；丹磺酰氯、邻苯二甲醛：德国Merck公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪（配SPDM20A二极管阵列检测器）：日本岛津公司；DTA-27超声波清洗器：鼎泰科技有限公司；Centrifuge 5804R离心机：德国Eppendorf公司；ZWM-UT1-10实验室专用超纯水系统：湖南中沃水务环保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准储备液和标准工作液的配制

精确称取（精确至0.000 1 g）牛磺酸固体标准品10.06 mg，用甲醇溶解定容至10.0 mL，折算固体标准品的纯度99.9%，计算得此标准溶液浓度为1.005mg/mL，放于棕色玻璃瓶中-18℃冷冻保存，此为标准储备液。精密吸取适量储备液，配制中间液，浓度为100.5 μg/mL，再依次稀释成系列浓度（2.01、5.02、10.05、20.10、40.20、60.30 μg/mL），此为标准工作液，现配现用。

1.3.2 样品前处理方法

经预试验表明，浓缩乳清蛋白粉Esprion300中未检测到牛磺酸，因此采用浓缩乳清蛋白粉Esprion300作为阴性试验样品。

1.3.2.1 提取

准确称取样品1 g（精确至0.000 1 g）至于50 mL塑料离心管中，加入适量40℃温水溶解，超声10 min，加入亚铁氰化钾+乙酸锌组合的沉淀剂，摇匀，转移至100.0 mL容量瓶，用水冲洗离心管，合并洗液于容量瓶中，用水定容至刻度，取适量离心后的上清液，待衍生。

1.3.2.2 衍生

DNFB衍生处理：取样品上清液及标准工作液各1.0 mL，于10 mL塑料管中，加入0.5 mL的1%DNFB衍生液（吸取DNFB 1.0 mL，用乙腈溶液定容至100.0 mL，现配现用）及1.0 mL的5%Na2CO3溶液，盖紧密封于60℃的水浴中衍生50 min，冷却，离心，取上清液过滤后上机测定。

Dansyl-Cl衍生处理：取样品上清液及标准工作液各1.0 mL，于10 mL塑料管中，加入1.0 mL的80 mmol/L碳酸钠缓冲液（用盐酸调节pH9.5），加入1.0 mL的1.5 mg/mL Dansyl-Cl衍生液（称取 Dansyl-Cl 0.15 g，用乙腈溶液定容至100.0 mL，现配现用），盖紧密封，避光反应90 min（每隔45 min摇匀一次），最后加入0.10 mL的20 g/L盐酸甲胺水溶液以终止反应，离心，取上清液过滤后上机测定。

OPA衍生处理：取样品上清液及标准工作液各1.0 mL，于10 mL进样小瓶中，加入0.5 mL的OPA衍生液（称取0.1 g OPA固体，用10.0 mL甲醇溶解，加入0.1 mL乙硫醇溶液，用0.4 mol/L的硼酸钠缓冲液定容至50.0 mL），准确反应120 s，立即上机测定。该衍生方法不进行批量处理，且所有试样及标准工作液从衍生反应至进样的时长需保持一致，并控制在5 min之内。

试样经液相色谱-二极管阵列系统分析，根据保留时间、光谱图及其二阶导数光谱图比较定性，外标法定量。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱，250 mm×4.6 mm，5.0 μm。流动相：A相为乙酸钠溶液0.820 g/L，用乙酸调 pH 4.2；B 相为乙腈；流动相体积比：A∶B=70∶30；流速 1.0 mL/min。柱温：20℃；进样量：20 μL。

1.4 数据处理

采用与SHIMADZU LC-20AT仪器配套的系统软件LC Real Time Analysis进行数据采集，软件LC Postrum Analysis-PDA进行数据处理分析。结果以平均值表示，采用WPS进行数据分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

特殊医学用途配方粉配方复杂，营养成分丰富，富含蛋白质、氨基酸等物质，在检测分析时易对牛磺酸造成干扰，易造成色谱柱堵塞，故在衍生前必须除去其蛋白质等干扰物质，实验室一般采用沉淀法。试验考察对比了亚铁氰化钾+乙酸锌组合盐析沉淀、乙腈有机沉淀2种不同沉淀方式对牛磺酸提取效率和回收率的影响，结果见图1和图2。

图1 不同沉淀方式对牛磺酸含量的影响Fig.1 Effect of different precipitation methods on content of taurine

图2 不同沉淀方式对牛磺酸回收率的影响Fig.2 Effect of different precipitation methods on recovery of taurine

图1和图2结果表明，使用亚铁氰化钾+乙酸锌组合沉淀剂的3种衍生方式，其牛磺酸含量和回收率均高于乙腈沉淀法，可能是牛磺酸在乙腈中的溶解度较低，乙腈在沉淀干扰物的同时也沉淀了牛磺酸[11]，同时部分样品的滤液出现轻微浑浊；亚铁氰化钾+乙酸锌通过氰化亚铁酸锌络合物沉淀干扰物质，样品滤液均澄清透明，牛磺酸提取率高，故选择亚铁氰化钾+乙酸锌进行干扰物质的去除。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 吸收波长的选择

用SHIMADZU SPD-M20A检测器于190nm～800nm的波长范围内对3种不同的标准工作液（40 μg/mL）衍生液进行光谱全波长扫描，结果见图3。

图3 3种不同衍生剂衍生的牛磺酸光谱图Fig.3 Spectra of taurine derived with three different derivatizing agents

从图3可以看出，DNFB、Dansyl-Cl、OPA 分别在354、249、334nm 处有较大吸收，故选择 354、249、334nm为相应衍生方式的最佳波长。

2.2.2 色谱柱的选择

试验选取了ZORBAX SB-C18和BEH RP 18两种不同色谱柱，比较其对牛磺酸分离效果的影响，以OPA衍生方式为代表，结果见图4。

图4 色谱柱对牛磺酸分离效果的影响Fig.4 Effect of chromatographic column on separation of taurine

图4结果显示，采用ZORBAX SB-C18柱的色谱峰细且窄，无拖尾现象，杂质与目标物分离效果较好，柱效优于BEH RP 18，故选择ZORBAX SB-C18。

2.3 方法学考察与比较分析

2.3.1 线性关系、检出限和定量限比较分析

按照1.3.2前处理后，试样经HPLC-PDA系统分析，以目标物的峰面积（Y轴）-标准物质质量浓度（X轴）绘制一元线性回归标准曲线，相关参数结果见表1。

表1 不同衍生方式的线性关系、检出限和定量限Table 1 Linear relationship，limit of detection，and limit of quantitation of different derivatizing agents

由表1可知，3种衍生剂处理的牛磺酸质量浓度在 2.01 μg/mL～60.30 μg/mL 的范围内，线性关系良好，线性相关系数（R2）均在0.999以上，符合方法验证规范要求。根据GB/T5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》，以3倍空白样品噪音比（S/N）和10倍空白样品噪音比（S/N）确定 DNFB、Dansyl-Cl、OPA 衍生的方法检出限（limits of detection，LOD）和方法定量限（limits of quantification，LOQ），当称样量为 1.0 g，定容体积为 100 mL 时，DNFB、Dansyl-Cl、OPA 3 种衍生方法的 LOD 分别为 1.5、1.5、2.0 mg/100 g，LOQ 分别为5.0、5.0、6.0 mg/100 g。

2.3.2 回收率和精密度比较分析

通过对标识无牛磺酸的浓缩乳清蛋白粉Esprion300样品进行本底测试及低、中、高3水平的加标回收试验，加标量分别为20、40 mg/100 g和80 mg/100 g，每个浓度水平进行6次平行试验，计算加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），同时做空白试验。结果见表2。

表2 不同衍生方式加标样品的回收率及精密度（n=6）Table 2 Recovery and precision of spiked samples with different derivatizing agents（n=6）

加标回收结果证明了3种衍生剂衍生牛磺酸方法的可靠性，其回收率为94.4%～103.7%，相对偏差RSD保持在3.1%～8.5%之间，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》方法验证规范要求（RSD≤15%），说明该3种方法能满足特殊医学用途配方粉中牛磺酸的测定要求，结果准确可靠。

2.3.3 稳定性比较分析

为考察衍生液的稳定性，将进样小瓶中衍生后的标准工作液（质量浓度为20.10 μg/mL），于-4℃冰箱中避光保存，分别在 0、12、24、36、48、72 h 进行重复性试验，每次连续进样6次，结果见图5。

图5 不同时间段不同衍生方法的稳定性研究（n=6）Fig.5 Stability of different derivation methods in different time periods（n=6）

图5表明DNFB在72 h内基本保持稳定，每次连续6针的相对标准偏差为1.3%，说明DNFB具有很好的稳定性[18]。Dansyl-Cl的衍生物在48 h内基本保持稳定，但随后呈下降趋势；OPA衍生产物不稳定，分解率高，衍生物牛磺酸含量降低得快，这与相关研究结果保持一致[19]，且每次连续进样6次，RSD＞10%，重复性差。

2.4 实际样品检测结果比较

特殊医学用途配方粉中牛磺酸的含量见表3。3种不同衍生方式的牛磺酸样品色谱图见图6。

表3 特殊医学用途配方粉中牛磺酸的含量（n=6）Table 3 Content of taurine in formula powder for special medical use（n=6） mg/100 g

图6 3种不同衍生方式的牛磺酸样品色谱图Fig.6 Chromatograms of taurine derived with three different agents

表3结果表明，浓缩乳清蛋白粉Esprion 300未检出牛磺酸，其余均有检出，且含量基本与标签标示值保持一致，在误差范围内，其中Dansyl-Cl衍生的牛磺酸含量略偏低于其他两种，Dansyl-Cl样品色谱图（图6），目标物附近杂峰较多，目标物积分不明确，容易干扰测定，可能是因为Dansyl-Cl虽然适合对含有仲胺等结构的物质进行衍生，但反应副产物多，使得目标物与其他具有相同紫外吸收性质的物质无法获取良好的分离度[20]。DNFB、OPA衍生方式的含量略高，可能是衍生物附近无干扰，与其他成分分离效果比较好，检测结果准确度高。

2.5 3种衍生方式操作过程比较

试验以批量处理20批次样品为例，从检测总时长、衍生操作步骤及结果准确性、稳定性等方面比较了 DNFB、Dansyl-Cl、OPA 3 种不同衍生处理方法，结果见表4。

表4 不同衍生方法整体比较Table 4 Overall comparison of different derivatizing agents

从表4检测时间及衍生操作过程看，OPA单个衍生时间短，仅5 min，但对衍生反应的时间要求严格，且不能批量衍生，检测总时长远远高于其他两种，说明OPA衍生不适合检测样本较多的情况，其他两种衍生过程均为60 min，检测总时长基本一致，衍生过程可批量处理，相对简单。从衍生物稳定性及结果准确性看，OPA衍生过程重复性差，衍生物不稳定，但是结果准确性高，DNFB和Dansyl-Cl衍生物稳定，可重复使用，但是Dansyl-Cl衍生反应副产物多，容易形成干扰和出现假阳性结果。从回收率看，DNFB、Dansyl-Cl、OPA回收率基本保持一致，为94.4%～103.7%，说明该3种检测方法均能满足特殊医学用途配方粉中牛磺酸的测定要求，结果准确可靠。

3 结论

试验建立了特殊医学用途配方粉经温水溶解、超声辅助提取、以DNFB、dansyl-Cl、OPA为衍生剂的3种不同柱前衍生方法，高效液相色谱-SPD二极管阵列检测器测定牛磺酸的检测方法。结果显示，3种不同的衍生方式均能满足特殊医学用途配方粉中牛磺酸的测定，Dansyl-Cl衍生虽相对稳定，但是反应活性较差，反应速度慢，易生成多级衍生产物干扰测定，OPA衍生前处理复杂，对生化反应要求严格，衍生产物不稳定，分解率高。DNFB衍生更能凸显优势，该方法不受样品基质干扰，相对快速，重复性好，结果准确性高，衍生物稳定性强，可广泛应用于特殊医学用途配方粉等复杂基质中牛磺酸的检测。