miR-124通过调节Jagged1/Notch信号通路影响肾细胞癌OS-RC-2细胞的恶性生物学行为

张炜，胡志，付桥，孙伟，徐律，褚浩，王潇，张志超（武汉市第三医院 泌尿外科，湖北 武汉 430074）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是肾原发肿瘤的主要类型[1]，在泌尿系统肿瘤中其发病率较高[2]。由于放化疗效果不理想，手术切除是RCC的主要治疗方法，但其术后复发率高达20%～40%[3]。因此，全面了解肿瘤进展的潜在分子机制有助于寻找RCC诊断和治疗的新模式。微小RNA（microRNA，miRNA）及其靶基因在细胞发育、增殖、凋亡、迁移和侵袭等许多生物学过程中发挥着重要作用。其中miR-124在肝癌[4]和RCC[5]等多种癌症细胞中均表达下调。在RCC 中，miR-124的低表达与RCC 的组织学分级、临床分期及淋巴结转移有关[6]。此外，miR-124也被证实能够通过靶向HDAC4 抑制RCC 细胞的自噬而增强顺铂敏感性[7]。Jagged1（JAG1）作为Notch配体，广泛表达于哺乳动物的多个组织和发育阶段，可间接激活Notch信号通路。JAG1/Notch通路可激活多种致癌因子，调节多种细胞功能[8]。本课题组利用生物信息学软件预测miR-124与JAG1之间可能存在靶向关系，由此推测miR-124对RCC的抑制作用可能与JAG1有关。为此，本研究通过上调miR-124 表达，观察其对RCC 恶性生物学行为的影响，并进一步探讨其与JAG1/Notch通路的调控关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2018 年6 月至2021 年10 月在武汉市第三医院行根治性手术治疗的38 例RCC 患者的RCC 组织和癌旁组织（距离肿瘤边缘4 cm处取材）标本。手术切除后，样本立即被冷冻在液氮中，并在-80℃保存以供分析。所有组织标本均用福尔马林固定，石蜡包埋。纳入标准：（1）所有患者在手术前均未接受过任何形式的辅助治疗；（2）经2017第8版国际抗癌联盟标准诊断为RCC；（3）签署知情同意书。排除标准：术前曾接受放疗、化疗、免疫治疗的患者。

38例患者根据2005国际泌尿病理协会的诊断标准划分：1级11例、2级13例、3级8例、4级6例。本研究获武汉市第三医院伦理委员会批准（批号：2018-0419）。

1.2 细胞与试剂及仪器

RCC 细胞（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OS-RC-2）和人正常肾细胞（293T）均购自北纳生物公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清购自武汉尚恩生物技术有限公司，青霉素-链霉素购自上海源叶生物科技有限公司，miR-124 mimic、NC mimic、miR-124 inhibitor、NC inhibitor、pcDNA 和pc-JAG1 均购自上海GenePharma 有限公司，Lipofectamine 2000 试剂盒购自北京诺为生物技术有限公司，TRIzol、SYBR Green ⅠPCR Master Mix 购自北京优尼康生物科技有限公司，miRNeasy Mini Kit 购自杭州沃森生物技术有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、MTT试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司，兔源一抗JAG1、cleaved caspase-3、BAX、Bcl2、NICD、HES1、HES5、GAPDH 单抗及辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗均购自美国Abcam公司。Nanodrop 2000微量紫外分光光度计购自深圳市瑞盛科技有限公司，ABI PRISM 7500 real-time PCR System 购自上海智岩科学仪器有限公司，Bio-rad Gel Dol EZ 成像仪购自上海艾研生物科技有限公司仪器部；多功能酶标仪购自珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司，Transwell 小室购自上海未熹生物科技有限公司，Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒购自上海生工生物公司，流式细胞仪购自碧迪医疗器械（上海）有限公司。

1.3 免疫组化法检测JAG1在RCC组织中的表达

免疫组化采用标准技术进行。4 μm石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡，在分级醇中再水化。室温下加入3%过氧化氢反应5 min，内源性过氧化物酶被阻断。蒸馏水冲洗后，将组织切片放入10 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH=6.0）中煮沸10 min，完成抗原回收。用5%～10%正常山羊血清反应30 min，进行非特异性蛋白结合。这些治疗与PBS冲洗交替进行。用JAG1多克隆抗体（1∶500）在室温下处理1 h后用PBS漂洗5 min，重复3 次，加入辣根过氧化物酶偶联二抗（1∶1 000）反应10 min，再用PBS 漂洗5 min，重复3次，用3,3-二氨基联苯胺染色，用苏木精复染，然后进行透明和封片处理。最后在显微镜下观察JAG1的表达情况。阴性对照是用非免疫血清替代一抗进行的。对照切片与样品平行处理。

所有染色切片均由3 位独立调查者以盲法进行评估。评分标准[9]：染色程度：无染色（0 分）、浅黄色（1分）、棕黄色（2分）、棕褐黄色（3分）；阳性细胞百分数：≤5%（0分）、＞5%～25%（1 分），＞25%～50%（2分），＞50%～75%（3分），＞75%（4分）。两者得分乘积为最终评分标准，≤3分为阴性，＞3分为阳性。

1.4 细胞培养和分组转染

将RCC 细胞（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OSRC-2）和人正常肾细胞（293T）置于含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的RPMI 1640 培养基中，并在37 ℃、5%CO2的加湿培养箱中培养。OS-RC-2 细胞汇合度达90%左右时，根据Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行转染：首先取0.8 µg 质粒DNA（NC mimic、miR-124 mimic、pcDNA、pc-JAG1）和2 µL Lipofectamine 2000 分别用50µL Opti-MEM 稀释，混合后静置20 min，将转染复合物置于24孔细胞板中，100µL/孔，与细胞混合均匀后培养48 h。实验分成5组：Control组（常规培养，不转染）、NC mimic组（转染NC mimic与Lipofectamine 2000复合物）、miR-124 mimic 组（转染miR-124 mimic 与Lipofectamine 2000复合物）、miR-124 mimic+pcDNA 组（共转染miR-124 mimic 和pcDNA 与Lipofectamine 2000 复合物）和miR-124 mimic+pc-JAG1 组（共转染miR-124 mimic和pc-JAG1 与Lipofectamine 2000 复合物）。qPCR 法检测转染后的干扰/过表达效果。

1.5 qPCR 法检测miR-124 和JAG1 mRNA 在RCC组织和细胞中的表达

采用TRIzol 根据miRNeasy Mini Kit 说明书从RCC 组织和细胞中提取总RNA。RNA 纯度和浓度用Nanodrop 2000 测定，随后RNA 在-80℃保存。将RNA 反转录成cDNA。以cDNA 为模板制备PCR 反应体系：cDNA 5 µL，SYBR Green ⅠPCR Master Mix 10 µL，正反向引物各0.4 µL，H2O 4.2 µL。PCR反应采用ABI PRISM 7500 real-time PCR System，具体的反应过程为95 ℃5 min、95 ℃20 s、59 ℃15 s，共39 个循环。采用U6/GAPDH 作为内参。miR-124和JAG1 mRNA 的相对表达量计算公式为2-ΔΔCt。所用引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-124 和JAG1基因间的靶向关系

采用在线生物信息学预测软件TargetScan检测miR-124和JAG1的结合位点。以psiCHECK2载体为基础，psiCHECK载体图谱如图1所示。构建野生型（WTJAG1 3'UTR）和突变型（MUT-JAG1 3'UTR）载体质粒。根据Lipofectamine 2000 试剂盒的说明制备转染混合物（0.8µg质粒DNA（NC mimic、miR-124 mimic、WTJAG1 3'UTR、MUT-JAG1 3'UTR）和2µL Lipofectamine 2000分别用50µL Opti-MEM稀释后均匀混合即可得到转染混合物），并采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测37 ℃培养24 h后的荧光素酶活性。共转染组为NC mimic+WT-JAG1 3'UTR 组、miR-124 mimic+WTJAG1 3'UTR组、NC mimic+MUT-JAG1 3'UTR组、miR-124 mimic+MUT-JAG1 3'UTR组。

图1 psiCHECK2载体结构图

1.7 WB法检测RCC组织和细胞中相关蛋白质的表达

提取组织和细胞的总蛋白，并根据BCA试剂盒的说明测定蛋白浓度。将提取的蛋白加入样品缓冲液（30 g/孔）中，95 ℃加热10 min。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离。用5%牛血清白蛋白在室温下封闭聚偏氟乙烯膜1 h。以4倍的比例加入一抗（1∶1 000）过夜（4 ℃）：JAG1、cleaved caspase-3、BAX、Bcl2、NICD、HES1、HES5和GAPDH。然后将辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）加入样品，室温反应1 h，用化学发光试剂处理样品，以GAPDH 作为内参对照。经Bio-rad Gel Dol EZ成像仪扫描记录。利用ImageJ软件对目标条带进行灰度值分析。

1.8 MTT 实验检 测miR-124 和JAG1 过表达对OS-RC-2细胞增殖的影响

转染后的OS-RC-2 细胞接种在96 孔板上，稀释到设计浓度（5×103个细胞/孔）。细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24、48和72 h。每孔加入20 μL的MTT（浓度5 mg/mL），继续培养4 h。然后小心取出孔内的培养液，各加入150µL二甲基亚砜，在摇床上缓慢震荡10 min，待结晶全部溶解后，使用多功能酶标仪在450 nm 波长下测量相应的光密度（D）值。根据公式计算RCC细胞活力：细胞活力=实验组D值/对照组D值×100%。

1.9 Transwell 实验检测miR-124 和JAG1 过表达对OS-RC-2细胞迁移的影响

迁移实验：将转染后的OS-RC-2 细胞放置在Transwell 的上腔室，下腔室则添加含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，37 ℃培养48 h 后，取出上室，去除未迁移细胞，用70%甲醛固定穿膜细胞30 min，用0.1%结晶紫染色穿膜细胞。倒置显微镜下捕捉迁移细胞的图像，随机选取5个区域计数迁移细胞。侵袭实验：操作步骤与迁移实验基本一致，只是上腔室需要预先铺满50 mg/L人工基膜1∶8稀释液。

1.10 流式细胞术检测miR-124 和JAG1 过表达对OS-RC-2细胞凋亡的影响

用胰蛋白酶消化细胞并离心（400×g）5 min，转染24 h后收集细胞，制成单细胞悬液（1×106/mL）。室温下，将100 μL细胞悬液注入试管中，同时将碘化丙啶与RNaseA混合，后与细胞在4 ℃下反应30 min。立即采用流式细胞仪进行检测和分析，使用Cell Quest 软件进行数据分析。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 RCC组织中miR-124呈低表达、JAG1呈高水平

qPCR、WB法检测结果显示，RCC组织中miR-124水平明显低于癌旁组织，JAG1 mRNA和蛋白水平则明显高于癌旁组织（均P＜0.01，图2）；RCC细胞系（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OS-RC-2）中miR-124水平明显比人正常肾细胞293T低，JAG1 mRNA和蛋白水平明显比人正常肾细胞293T高（均P＜0.05），且OS-RC-2细胞中miR-124水平最低，JAG1 mRNA 和蛋白水平最高（均P＜0.05，图3），因此选择OS-RC-2细胞进行转染实验。免疫组化检测结果（图4）显示，JAG1染色主要存在于细胞膜和/或细胞质中。JAG1 在RCC 组织中的阳性表达率为92.11%（35/38），阴性表达率为7.89%（3/38）；在癌旁组织中的阳性表达率为28.95%（11/38），阴性表达率为71.05%（27/38），差异有统计学意义（χ2=31.722，P＜0.05）。免疫组化评分结果显示，癌旁组织JAG1蛋白阳性表达评分明显低于RCC 组织[（2.56±0.24）vs（5.89±0.36）分，t=23.089，P＜0.05]。

图2 miR-124和JAG1蛋白在RCC组织中分别呈低表达和高表达

图3 miR-124和JAG1蛋白在RCC细胞中分别呈低表达和高表达

图4 JAG1在RCC组织和癌旁组织中的表达（×400）

2.2 miR-124直接负调控JAG1

TargetScan 预测软件结果（图5A）显示，miR-124与JAG1 3'UTR 存在作用位点。双荧光素酶报告基因实验检测结果（图5B）显示，与NC mimic+WTJAG1 3'UTR组相比，miR-124 mimic+WT-JAG1 3'UTR组荧光素酶活性被显著抑制（P＜0.05），而miR-124 mimic+MUT-JAG1 3'UTR 组荧光素酶活性抑制不明显（P＞0.05）。qPCR、WB 法检测结果（图6）显示，miR-124 mimic 组JAG1 mRNA 和蛋白表达显著低于NC mimic 组，miR-124 inhibitor 组JAG1 mRNA和蛋白表达显著高于NC inhibitor组（均P＜0.05）。

图5 双荧光素酶报告基因实验验证miR-124负调控JAG1

图6 miR-124抑制OS-RC-2细胞中JAG1 mRNA（A）和蛋白（B）的表达

2.3 miR-124抑制OS-RC-2细胞增殖

qPCR、WB 法检测结果（图7）显示，与Control 组和NC mimic组比较，miR-124 mimic组OS-RC-2细胞中miR-124 表达升高，JAG1 mRNA 和蛋白表达降低（均P＜0.05）；与miR-124 mimic+pcDNA组和miR-124 mimic 组相比，miR-124 mimic+pc-JAG1 组OS-RC-2细胞中miR-124 表达降低，JAG1 mRNA 和蛋白表达升高（均P＜0.05）。

图7 共转染miR-124 mimic和pc-JAG1抑制OS-RC-2细胞中miR-124的表达（A）促进JAG1表达（B）

MTT 法检测结果（图8）显示，miR-124 mimic 组OS-RC-2 细胞活力（24、48、72 h）显著低于Control 组和NC mimic组，miR-124 mimic+pc-JAG1 组OS-RC-2细胞活力（24、48、72 h）显著高于miR-124 mimic+pcDNA组和miR-124 mimic组（均P＜0.05）。

图8 共转染miR-124 mimic和pc-JAG1提高OS-RC-2细胞的活力

2.4 miR-124 抑制OS-RC-2 细胞迁移和侵袭而促进凋亡

Transwell 实验检测结果（图9）显示，较Control组和NC mimic 组而言，miR-124 mimic 组迁移、侵袭细胞数目显著减少，凋亡率显著升高，cleaved caspase-3 和BAX 蛋白表达明显增加，Bcl2 蛋白表达明显减少（均P＜0.05）；相比miR-124 mimic+pcDNA组和miR-124 mimic 组，miR-124 mimic+pc-JAG1 组迁移、侵袭细胞数目明显增多，凋亡率明显降低，cleaved caspase-3和BAX蛋白表达显著降低，Bcl2蛋白表达显著增加（均P＜0.05）。

图9 共转染miR-124 mimic和pc-JAG1促进OS-RC-2细胞迁移和侵袭并抑制其凋亡

2.5 miR-124 抑制OS-RC-2 细胞中Notch 信号通路相关蛋白表达

WB 检测结果（图10）显示，miR-124 mimic 组OS-RC-2细胞中NICD、HES1、HES5蛋白表达显著低于Control 组（均P＜0.05），miR-124 mimic+pc-JAG1组OS-RC-2 细胞中NICD、HES1、HES5 蛋白表达显著高于miR-124 mimic组（P＜0.05），而NC mimic组和Control 组、miR-124 mimic+pcDNA 组 和miR-124 mimic 组OS-RC-2 细胞中NICD、HES1、HES5 蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。

图10 共转染miR-124 mimic 和pc-JAG1 促进OS-RC-2 细胞中Notch信号通路相关蛋白的表达

3 讨论

男性、年龄增长、吸烟和遗传易感性均是目前公认的RCC危险因素。由于缺乏诊断生物标志物和早期特殊症状，约20%～30%的RCC患者在初始诊断时就有转移[10]。而且，经手术治疗后，RCC 患者发生转移或复发的概率仍然较高，约为50%，这与预后不良有关[11]。因此，了解RCC 复发和转移的分子机制对改善RCC治疗意义重大。

近年来研究发现miRNA 在RCC 的生物学过程中发挥重要作用。miR-124 是一种肿瘤抑制因子，SHEN 等[12]指出miR-124 在黑色素瘤组织中表达降低，过表达miR-124 可通过降解RACK1 抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，促进黑色素瘤细胞凋亡；FAN 等[13]的研究结果表明，miR-124 可通过抑制IQGAP1 的表达抑制结直肠癌的进展；在食管癌中，miR-124可抑制细胞侵袭和迁移，其抑制作用与靶向调控BECN1有关[14]；而在RCC中，miR-124过表达可抑制MMP-9表达，降低RCC 细胞的侵袭能力[15]。本研究结果显示，miR-124 在RCC 组织和细胞中呈低表达，与ÇAYKARA等[16]的研究结果一致，说明miR-124在RCC 中发挥抑癌作用。由于miR-124 在OS-RC-2细胞的表达与人正常肾细胞293T 差异最大，所以本研究选择OS-RC-2细胞中进行后续实验。

本研究通过在OS-RC-2 细胞中转染miR-124 mimic发现，miR-124表达显著升高，说明细胞转染成功；此外，过表达miR-124 可有效抑制RCC 细胞增殖、迁移和侵袭，促进RCC 细胞凋亡。Cleaved caspase-3 是caspase-3 的激活形式，细胞中cleaved caspase-3表达水平与凋亡率呈正比。BAX和Bcl2属于同一个家族，且均与细胞凋亡有关，但两者作用相反，BAX促进细胞凋亡，而Bcl2抑制细胞凋亡[17]。本研究结果显示，转染miR-124 mimic 可显著升高cleaved caspase-3和BAX蛋白表达、降低Bcl2蛋白表达，这与凋亡检测结果相对应，揭示miR-124 对RCC细胞凋亡的促进作用与cleaved caspase-3、BAX、Bcl2蛋白的表达水平有关。

JAG1 是Notch 典型的配体之一，已有研究证实JAG1 在肝癌[18]、乳腺癌[19]等不同类型的肿瘤中发挥促癌作用。本研究发现，JAG1在RCC组织和细胞中的表达显著升高，这与吴科荣等[20]的研究结果一致，提示JAG1 在RCC 中也作为促癌因子起作用。PAN等[21]指出，miR-124 通过靶向JAG1 抑制胃癌进展。而本研究通过TargetScan 预测软件得到miR-124 与JAG1 3'UTR 互补的核苷酸位点。进一步研究发现，miR-124 靶向负调控JAG1 的表达。此外，回复实验结果显示，过表达JAG1 可逆转miR-124 过表达对RCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用。

JAG1 可通过细胞间的相互作用触发Notch 信号。在宫颈癌、舌癌中，JAG1 表达的升高可激活Notch信号通路，并进一步诱发下游基因的转录和翻译，而上游的miRNA对JAG1的表达和Notch信号通路具有调控作用[22-23]。NICD 是Notch 受体的一种激活形式，通过激活的Notch信号通路可以释放NICD，从而增加HES1、HES5 等HES 家族表达[24]。HES1 和HES5 对Notch 信号通路至关重要，可以抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭、迁移和增殖[25]。本研究结果显示，miR-124 过表达时，NICD、HES1、HES5 蛋白表达下降，而过表达JAG1 会干扰miR-124 对NICD、HES1、HES5 蛋白表达的抑制作用，揭示miR-124 通过下调JAG1，抑制Notch信号通路的激活。

综上所述，本研究发现，miR-124 通过抑制JAG1/Notch信号通路，抑制RCC细胞迁移、侵袭和增殖，加速RCC 细胞凋亡，为RCC 的机制研究提供了参考依据。