低蛋白日粮补充天冬氨酸对断奶至育肥阶段猪生长性能及肉品质性状的影响

关 鹏，王晨昱，胡 鲜，何流琴，李建中，李铁军

(1.湖南师范大学生命科学学院 动物肠道功能湖南省重点实验室，长沙 410081；2.中国科学院亚热带农业生态研究所 动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室，长沙 410125；3.中国科学院大学，北京 100049)

我国饲用蛋白质资源严重匮乏以及大宗非粮蛋白资源利用率极低，严重制约了我国饲料业和畜牧业的发展。大力开发低蛋白饲粮配制技术是提高蛋白原料利用率，节约饲料资源和降低养殖成本的重要方法。美国NRC(2012)营养需要量标准中仔猪、生长猪以及育肥猪配合饲料粗蛋白(crude protein，CP)需要推荐量分别是20%、18%和16%， 而低蛋白日粮是指在不影响生长性能的前提下按NRC推荐标准降低2～4个百分点的日粮。目前，对低蛋白日粮的研究大多只关注平衡必需氨基酸，却忽略了低蛋白日粮也可能导致非必需氨基酸失衡，从而降低猪生长性能。天冬氨酸(aspartate，Asp)又称天门冬氨酸，虽传统营养学中被认为是非必需氨基酸，但其处于糖酵解、嘌呤嘧啶合成等代谢的中间枢纽位置，故在代谢中属于功能性氨基酸。其除了可参与机体蛋白质合成外，在能量代谢、免疫和抗氧化应激等方面都发挥着重要作用。有研究表明，Asp能通过改变回肠末端微生物的菌群区系，进而影响猪的脂肪代谢。也有研究发现，日粮添加0.5%或1.0%Asp可提高肠道乳糖酶和蔗糖酶活性，改善肠道形态结构，进而反转因脂多糖引起的断奶仔猪生长性能下降。但在实践生产中，本团队前期研究发现，日粮添加1.0%的Asp不影响断奶仔猪的生长性能，但低蛋白日粮条件下添加0.5%Asp对断奶至育肥阶段猪生长性能、营养物质消化率和肉品质性状影响的研究尚无报道。因此，本研究通过探讨低蛋白日粮添加0.5%Asp对其生长性能、血液生理生化指标、营养物质表观消化率和肉品质性状的影响，以期为低蛋白日粮非必需氨基酸的添加水平及饲粮的精准配制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

-天冬氨酸(纯度≥98%)购于张家港市思普生化有限公司。基础日粮购自长沙粒丰饲料科技有限公司，三元杂交(杜洛克×长白×大约克)断奶仔猪购于湖南龙华农牧发展有限公司。

1.2 试验设计

试验选取20头平均体重为(10.93±0.79) kg的健康三元杂交(杜洛克×长白×大约克)断奶仔猪，随机分成两组，每组10个重复，每个重复1头猪，仔猪全部单栏饲养。试验周期共分为3个阶段：断奶阶段、生长阶段、育肥阶段，为期84 d。在断奶、生长、育肥阶段，对照组(Con)分别饲喂粗蛋白质含量为17%、15%、13%的玉米-豆粕型基础日粮，试验组(Asp)饲喂在基础日粮中添加0.5%天冬氨酸的试验饲粮。天冬氨酸采用取代部分玉米原料的方式添加，非额外添加。基础日粮参照NRC(2012)猪营养需要标准进行配制，基础日粮的组成及营养水平见表1，基础日粮中不添加抗生素和防霉剂。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air dry basis) %

1.3 饲养管理

本试验在中国科学院亚热带农业生态研究所动物楼进行，仔猪采用不锈钢单栏饲养。断奶、生长与育肥阶段均自由采食与饮水。每天准确记录每只猪的采食量与健康状况，并按照猪场常规饲养管理程序对仔猪进行其他饲养管理与免疫，定时进行猪舍的消毒与清扫，保持猪舍清洁与通风。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 生长性能 准确记录各组试验猪的采食量，计算每头猪的平均日采食量(ADFI)，并于试验第1、28、63和84天，以栏为单位空腹称重，计算每头猪的平均日增重(ADG), 根据猪的ADFI和ADG计算料重比(F/G)。

1.4.2 血清生化指标 分别于试验第28、63和84天，各组试验猪空腹12 h后，进行前腔静脉采血。并在4 ℃、3 000 r·min条件下离心15 min制备血清。于-20 ℃冰箱中冻存。用于血清生化指标和血清游离氨基酸含量检测。

血清中的总蛋白(total protein, TP)、白蛋白(serum albumin, ALB)、谷丙转氨酶(alanine amino transferase, ALT)、谷草转氨酶(serum aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、尿素氮(serum urea nitrogen, BUN)、葡萄糖(glucose, GLU)、血氨(serum ammonia)含量采用CX4型全自动生化分析仪 (美国Backman公司)进行检测，试验操作均按相应试剂盒说明进行。

1.4.3 血清游离氨基酸 吸取约2 mL样品于离心试管中，3 000 r·min离心5 min，准确吸取上清液1 mL于另外的离心试管中，加入8%磺基水杨酸1 mL，混匀，静置15 min，离心过后取下层水相，过0.22 μm滤膜后装入上样瓶存于4 ℃，用氨基酸分析仪(L-8900，日本) 测定游离氨基酸的含量。

1.4.4 营养物质表观消化率 分别于育肥阶段试验结束前3 d，以栏为单位进行粪便收集，固定收粪时间为每天下午3点，连收3 d，采用盐酸不溶灰分(AIA)作为内源指示剂测定粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)、粗纤维(CF)表观消化率。

养分表观消化率(%) =100-(饲粮中AIA含量/粪中AIA含量)×(粪中养分含量/饲粮中养分含量)×100。

1.4.5 肉品质性状 屠宰后的胴体沿背中线分开，左半部分用于肉品质分析，参照NY/T 821—2004《猪肌肉品质测定技术规范》相关方法测定背最长肌的pH、肉色等胴体品质指标。

1.4.6 实时荧光定量 使用TRIzol试剂从背肌组织中分离出总RNA。分离的RNA用Nano Drop 2000c分光光度计(Thermo，美国)测定RNA浓度和稳定性。利用逆转录试剂盒(Thermo，美国)合成了第一条cDNA链。每一个样本用SYBR-Green实时PCR系统进行3次评估。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，在95 ℃下扩增45个循环10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，扩增检测慢速氧化型肌纤维(1)、快速氧化型肌纤维(2a)、快速酵解型肌纤维(2b)、中间型肌纤维(2x)和内参(-)的表达。使用2方法计算相对表达。引物如表2所示。

表2 本试验所用引物序列Table 2 The sequence of primers used in this study

1.5 数据处理及统计分析

采用Excel 2010进行试验数据整理，并用SPSS 22.0软件进行独立样本检验。以<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结 果

2.1 低蛋白日粮添加Asp对猪在断奶至育肥阶段生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，断奶阶段，试验组ADG较对照组提高了15.69%(<0.05)， F/G极显著降低了17.03%(<0.01)，ADFI无显著差异(>0.05)；生长阶段与育肥阶段，试验组与对照组相比，ADFI、ADG、F/G均无显著差异(>0.05)。断奶至育肥阶段生猪饲喂补充0.5%Asp的低蛋白日粮，从整体效果来看，对其生长性能无显著影响。

表3 低蛋白日粮添加Asp对猪断奶、生长、育肥阶段生长性能的影响Table 3 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on growth performance of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.2 低蛋白日粮添加 Asp对猪在断奶至育肥阶段血液生化指标的影响

由表4可知，断奶阶段，与对照组相比，试验组断奶仔猪血清ALB和ALP显著升高(<0.05)，分别升高了30.19%和33.64%，但对 TP、ALT、AST等无显著影响(>0.05)；生长阶段与育肥阶段，与对照组相比，试验组血清ALB、ALP、TP、ALT、AST等均无显著差异(>0.05)。

表4 低蛋白日粮添加Asp对猪在断奶、生长、肥育阶段的血液生化的影响Table 4 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on blood biochemical indexes of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.3 低蛋白日粮添加Asp对猪在断奶至育肥阶段血清游离氨基酸含量的影响

由图1可知，断奶阶段，与对照组相比，试验组断奶仔猪血清Pro、Met、Phe和Thr含量显著降低(<0.05)，分别降低了35.49%、47.66%、22.64%和23.66%。试验组断奶仔猪血清Asp、His和Tyr极显著低于对照组(<0.01), 分别降低了26.93%、48.42%和50.41%。与对照组相比，试验组断奶仔猪血清氨态氮和Lys极显著升高(<0.01)，分别提高了34.13%和57.30%。生长阶段，与对照组相比，试验组生长猪血清中Asp和Lys含量显著低于对照组(<0.05)，分别降低了25.33%和20.63%；试验组生长猪血清氨态氮含量极显著降低了19.74% (<0.01)。育肥阶段，试验组与对照组相比，血清Asp和Thr含量显著降低(<0.05)，分别降低了29.10%和30.33%。

*. 表示存在显著性差异(P<0.05)；**. 表示存在极显著性差异(P<0.01)。下图同*. Indicates that there is significant difference (P<0.05); **. Indicates that there is extremely significant difference (P<0.01). The same as below图1 低蛋白日粮添加Asp对猪断奶、生长、育肥阶段的血清游离氨基酸的影响Fig.1 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on serum free amino acids of pigs during weaning, growing and fattening stages

2.4 低蛋白日粮添加Asp对猪在育肥阶段养分表观消化率的影响

由表5可知，与对照组相比，育肥猪总能、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和粗纤维表观消化率极显著升高(<0.01)，分别升高了3.08%、4.69%、4.07%、21.50%和38.35%。

表5 低蛋白日粮添加Asp对育肥猪养分表观消化率的影响Table 5 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on nutrient apparent digestibility of fattening pigs %

2.5 低蛋白日粮添加Asp对猪在育肥阶段肉品质的影响

由表6可知，屠宰后45 min，试验组肉色与pH较对照组均无显著差异(>0.05)；屠宰后24 h，与对照组相比，试验组肉色、pH、剪切力均无显著差异(>0.05)，但试验组熟肉率极显著提高了6.49% (<0.01)。

表6 低蛋白日粮添加Asp对育肥猪肉品质的影响Table 6 Effect of low-protein diet supplemented with Asp on meat quality of fattening pigs

2.6 低蛋白日粮添加Asp对猪在育肥阶段肌纤维分子mRNA相对表达量的影响

由图2可知，与对照组相比，试验组1的mRNA的相对表达量显著提高了57%(<0.05)，2a、2b和2x等mRNA的相对表达量无显著差异(>0.05)。

图2 低蛋白日粮添加Asp对育肥猪肌纤维分子相对表达量的影响Fig.2 Effects of low-protein diet supplemented with Asp on molecular relative expression of muscle fiber in fattening pigs

3 讨 论

3.1 低蛋白日粮添加Asp对猪在断奶至育肥阶段生长性能和血液生化指标的影响

以玉米-豆粕为基础并通过平衡Lys、Met、Thr和Trp等氨基酸的低蛋白猪饲料，目前在猪养殖中已成功应用。本试验结果发现，低蛋白日粮添加0.5%Asp对猪在生长和育肥阶段的生长性能无显著影响，但能够有效改善其在断奶阶段的平均日增重和料重比。提示猪在断奶阶段对Asp的需求增加，低蛋白日粮不足以满足其正常的营养需求。这可能是因为Asp作为一种功能性氨基酸，在低蛋白日粮条件下添加Asp可促进仔猪机体能量、蛋白质等代谢，改善肠道功能，进而有效缓解仔猪断奶应激和提高免疫力，而生长肥育阶段猪已适应环境，体内合成的Asp足以满足正常需求，故对其生长性能无显著影响。同时，本试验结果也与石海峰和段杰林研究结果一致，表明断奶仔猪在免疫或氧化应激条件下，日粮添加0.5%或1%的Asp可有效改善仔猪生长性能。众所周知，血清中TP和ALB指标能够反映机体蛋白质代谢和免疫力情况，血清中TP含量升高，则表明机体蛋白质合成增加，血清ALB能够清除自由基，同时能够保护机体免疫系统。本研究发现，低蛋白日粮中添加0.5%Asp能够显著提高猪在断奶阶段血清中的ALB和TP含量，但对生长和肥育阶段无显著影响，这也进一步说明低蛋白日粮添加Asp可提高断奶阶段生长性能的原因。Asp不仅可以促进血清中免疫指标的升高，也有研究表明Asp可以作为中枢和外周神经系统中的神经递质，在调节免疫反应中发挥作用，并且，Asp还能够参与巨噬细胞中精氨酸-NO循环，促进细胞中NO的生成，能够增强机体抗微生物和有害细胞的能力，这也可能是Asp能通过改善仔猪免疫力，从而改善仔猪生长性能的原因。

3.2 低蛋白日粮添加Asp对血清游离氨基酸含量及营养物质表观消化率的影响

动物机体氨基酸代谢和蛋白质沉积情况可通过血清游离氨基酸的变化得到体现。本研究发现，低蛋白日粮添加0.5%Asp可显著降低猪在断奶、生长、育肥阶段血清中Asp的含量，表明低蛋白情况下，Asp能够促进猪机体对血清游离Asp的利用率，可更好地维持猪生长过程中肠道的发育及能量状态；Pro和Thr能够阻止淋巴细胞的凋亡，并促进抗体的产生，本研究证实，低蛋白日粮添加0.5%Asp极显著降低了断奶仔猪血清中Pro的含量，并显著降低了断奶仔猪和育肥猪血清Thr水平，表明添加Asp有利于促进断奶仔猪和育肥猪血清中Pro和Thr的利用，改善机体免疫状态；Lys是猪第一限制性氨基酸，其不仅能够进入三羧酸循环，为蛋白质合成供能，并参与机体酶、骨骼肌和一些激素的合成，Met属于含硫氨基酸，其代谢物不仅在缓解氧化应激发面发挥重要作用，还能为机体蛋白质和核酸甲酰化提供甲基，提高蛋白活性，在本试验中，日粮添加Asp极显著提高了断奶仔猪血清中Lys含量，并使Met含量显著降低，表明在低蛋白情况下，日粮添加0.5%Asp有利于断奶仔猪的蛋白沉积。众所周知，豆粕中含有的抗胰蛋白酶、尿毒酶等能够破坏小肠结构进而影响饲料的消化吸收，低蛋白氨基酸平衡日粮更加有利于猪对营养物质的利用，胡琴等研究表明，低蛋白日粮能够有效提高育肥猪干物质和粗脂肪消化率，本研究也获得类似结果，同时，本试验还发现低蛋白日粮添加0.5%Asp可显著提高育肥猪总能、粗蛋白等表观消化率。本试验结果表明，低蛋白日粮添加0.5%Asp可提高全程饲养(育肥猪)血清中氨基酸利用率和营养物质表观消化率，这可能与Asp能够提高肠黏膜中二糖酶的活性和调节肠道氨基酸转运载体的表达相关，对于育肥阶段养分表观消化率提高，生长性能却没有显著改变，可能与猪在此阶段对营养物质的利用率不充分有关，但其具体原因，仍需要进一步研究。

3.3 低蛋白日粮添加Asp对猪在育肥阶段肉品质和肌纤维相关基因mRNA表达量的影响

育肥猪的肉质性状受到多种因素调节，其中肌纤维类型对肉品的pH、肉色、嫩度、肌内脂肪含量等具有重要的影响。猪的肌纤维在代谢上可分为慢速氧化型(1)、快速氧化型(2a)、快速酵解型(2b)和中间型(2x)等4种类型。研究表明，蛋白水平影响肌纤维类型的组成，饲喂低蛋白日粮的猪具有更高比例的氧化型肌纤维，氧化型肌纤维脂质含量更高，其中慢速氧化型(1)有利于增加猪肉的嫩度与多汁性，本研究也获得类似结果，在低蛋白条件下，全程饲喂0.5%Asp可显著提高1的mRNA表达量，并显著提高了肉品熟肉率；而熟肉率、系水力能够体现肉品的多汁性，这也进一步说明低蛋白日粮添加0.5%Asp能够增加肉品的多汁性。低蛋白日粮添加0.5%Asp对肉品质具有一定改善作用，其原因可能与Asp能够促进肌纤维向1型肌纤维转化有关，通过改变肌纤维的类型来调节肌内脂肪含量；其次，Asp还可能通过调节脂肪细胞中脂质的合成和分解来调节脂肪含量。研究表明，Asp能够改善肠道微生物的丰度，肠道微生物及其代谢物可通过与肠上皮细胞G蛋白偶联受体结合调控宿主机体的代谢反应，从而影响营养物质沉积，还有研究发现，肠道微生物代谢产生的短链脂肪酸通过与G蛋白偶联受体结合能够调节脂肪的生成与分解，从而能够影响脂肪的沉积，这可能也是Asp能够改善肉质的一个重要原因。

4 结 论

断奶至育肥阶段猪全期饲喂添加0.5%Asp的低蛋白日粮，仅对断奶阶段仔猪生长性能具有改善作用；但通过全期饲喂，低蛋白日粮补充0.5%Asp却可提高营养物质表观消化率，促进血清氨基酸利用率，并通过提高1的mRNA表达量改善肉品熟肉率，有利于改善肉品质性状。