LC-MS/MS测定青稞中氨基酸的含量及主成分分析

王猛强，邱 城，张唐伟，李腾飞，李 壮，王 淼，曹 振，王珊珊，郑鹭飞，金茂俊，王 静，邵 华，金 芬，佘永新*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；3.西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，西藏拉萨 850000)

青稞是我国青藏高原的主要粮食作物之一，非常适合种植在青海、西藏、四川、甘肃、云南等高海拔地区，特定的地理环境和气候条件，赋予其独特的营养成分，具有良好的经济和食用价值。青稞中的氨基酸组成成分较为全面，不同地区、不同品种的青稞其氨基酸的含量差异较大,因此氨基酸的含量常作为评价青稞中营养价值重要的指标之一。目前青稞中氨基酸含量的检测主要有气相色谱法、液相色谱法、分光光度法、毛细管电泳法、化学发光法、近红外光谱法、荧光光谱法等方法。张红漫等利用气相色谱串联质谱技术，通过对水解液的衍生化，实现了对沙宛子中氨基酸的定量分析；刘百战等采用毛细管气相色谱法，通过氯甲酸乙酯衍生化，实现了对卷烟中游离态氨基酸的定量分析；张国华等采用液相色谱串联质谱的方法，通过异硫氰酸苯酯(PITC)作为柱前衍生化试剂，实现了对莲雾中15种游离氨基酸的定量检测；孔祥虹等利用超高效液相色谱串联质谱的方法，通过异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法，实现了浓缩果汁中20种氨基酸的定性定量分析。这些检测方法各有优缺点，有些方法其分析时间较长(在1 h以上)、检测效率低，或者需要柱前、柱后衍生，检测步骤较为烦琐等。利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测氨基酸可以解决检测时间长、避免衍生化等问题，因此，建立青稞中氨基酸含量的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法具有重要现实意义。

主成分分析法(PCA)是目前常用的统计方法，是一种将多指标转化为几个不相关综合指标的多元统计分析方法，其通过数据降维，排除众多信息的相互重叠部分，能够尽可能多地表征原数据特征而不丢失信息。该试验通过建立高效液相色谱串联质谱方法测定不同区域青稞中氨基酸的含量，并结合主成分分析，评价不同品种的青稞氨基酸的组成差异，为青稞品种的适应性和品质特性提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

青稞材料。来自5个产地的30个品种，具体材料信息如表1所示。

试剂。盐酸，分析纯，北京百汇佳兴试剂公司；甲醇、乙腈、甲酸，色谱纯，美国Fisher公司。标准品甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸(≥98%)，上海源叶生物有限公司。标准品丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸(≥99%)，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

仪器。Agilent1200 液相色谱，美国Agilent公司；AB5000三重四级杆质谱，美国SCIEX公司；旋转蒸发仪，日本 EYELA公司；电子天平，美国ScienTific Industries公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

表1 青稞试验材料品种及来源地

标准混合液的配制。适量称取13种氨基酸化合物标准品，溶解在0.1 mol/L盐酸水溶液中，配制成1.25 mmol/L的标准混合液，保存在-20 ℃冰箱中。

色谱条件。选择3种不同的分离色谱柱进行分离，分别是XBridgeC(5 μm,2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ (3 μm，2.1 mm×100 mm),利用分离结果选定较好的色谱柱。

流动相的优化，即采用水相流动相分别为0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L甲酸铵水溶液，有机流动相选择乙腈分别进行优化；进样体积2 μL;流速0.3 mL/min，柱温25 ℃。

质谱条件优化。该方法的质谱条件选择带有三重四极杆的质谱仪。检测模式为多反应监测(MRM)。离子源温度设定为450 ℃，碰撞气(CAD)压力设定68.95 kPa，气帘气(CUR)设为241.32 kPa，雾化气(GS1)压力设定为241.32 kPa；辅助加热气(GS2)压力设定为206.84 kPa。并对各个氨基酸的前体离子、产物离子、扫描时间、碰撞电压等进行了优化。氨基酸具体的质谱参数如表2所示。

样品前处理。将青稞样品进行超微粉碎，过55目筛子，用密封袋装好备用，保存在-20 ℃的冰柜中。精密称取0.1 g青稞粉碎后全粉样品，精确到0.000 1 g，放入220 mL的玻璃消解管，再加入体积比为1+1的浓盐酸10 mL，在涡旋仪上振荡2 min，超声10 min，进行氮吹除氧，迅速关上盖子，放到110 ℃的真空干燥箱中进行加热水解，取出水解液后，采用定量滤纸过滤。吸取1 mL进行氮吹(或烘干)，再用纯水复溶，稀释10倍后，过0.22 μm滤膜后上机检测。

利用SPSS统计软件进行主成分分析，采用Excel数据分析软件进行数据整理与统计。

2 结果与分析

结合XBridgeC(5 μm，2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ(3 μm,2.1 mm×100 mm)这3个色谱柱，流动相A选择0.1%甲酸水、0.2%甲酸水和5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B选择乙腈，分别进行分离优化，结果发现C柱的分离效果较差，在1～3 min分离出色谱峰，色谱柱

表2 质谱参数

接下表

保留能力较差，流动相使用0.1%甲酸水，分离效果较好。最终选择XBridgeHILIC(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)色谱柱，流动相A是0.1%甲酸水，流动相B为乙腈，然后通过调试流动相洗脱程序，最终确定其梯度洗脱方法如表3所示，能够较好地分离这13种氨基酸物质，其选择离子色谱图如图1所示。

氨基酸的检测分析主要在将样品中的多肽和蛋白质样品进行完全水解，使其游离出所有的氨基酸，参照国标方法进行前处理，确定了水解时间在12 h、水解温度在110 ℃时，氨基酸的水解最为彻底。

表3 梯度洗脱程序

图1 氨基酸选择离子色谱图Fig.1 Selected ion chromatogram of amino acids

取各个氨基酸的标准品，用0.1 mol/L盐酸溶解，配制成5个浓度的标准品溶液，分别为1.25、2.50、5.00、12.50、65.00 nmol/mL。以标准品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。13种氨基酸在1.25～65.00 nmol/mL具有良好的线性关系，其结果如表4所示。

表4 13种氨基酸的线性关系

称取同一份样品5次，依据“..”样品前处理方法操作，在试验条件下测定，结果发现(表5)，13种氨基酸的方法精密度的相对标准偏差(RSD)在3.05%～6.93%，表明该方法有较好的精密度。

表5 精密度试验(n=5)

精密称取0.1 g样品9份，分别加入氨基酸混合标准溶液(浓度为1.25 mmol/mL)20、50、100 μL，结果表明(表6)，按试样制备方法处理样品中13种氨基酸的平均回收率在76.43%～101.39%，RSD≤12.12%。表明该方法有良好的准确度。

表6 加标回收率和相对标准偏差(n=3)

采用液相色谱串联质谱法对30个青稞品种中氨基酸含量进行检测，结果如表7所示，在13种氨基酸中谷氨酸含量最高，对这些青稞样品中的氨基酸指标进行主成分分析，其结果见表8，主成分分析一共提取出特征根均大于1的5个主成分，其方差贡献率分别是30.664%、18.933%、13.455%、8.809%、7.937%，累计方差贡献率为79.798%。由表9可知，主成分1()在甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸上有较多的载荷量，相关性较大，主成分2()在谷氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸的相关性较大，主成分3()在丙氨酸、酪氨酸的相关性较大，主成分4()在苯丙氨酸、亮氨酸的相关性较大，主成分5()在甘氨酸、苏氨酸的相关性较大。

表7 30种青稞中氨基酸的含量

表8 青稞中氨基酸的特征根和方差贡献率

根据提取的5个主成分的成分得分系数(表10)，利用其特征向量，得到其线性组合如下：

=0107+0076+0204-0011-0237+0001-0036+0209-0224-0002+0153+0131-0013

表9 主成分的载荷系数

=-0147+0284+0065+0257+0009-0062+0193+0046+0080+0274-0051+0103+0309

=-0167+0125+0129-0091+0037+0504+0362+0024+0051-0013+0210-0196-0176

=0263-0223-0000-0000+0097+0169-0343+0121+0187+0516+0385-0298+0215

=0550-0213+0148+0597+0074+0061+0277-0004+0135+0021-0145+0075-0334

式中，、、、、、、、、、、、、分别代表甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸含量。

综合得分是方差贡献率与成分得分乘积后累加计算可得，其模型为=0384+0237+0169+0110+0099。由此可以计算各个青稞样品中的综合得分，并进行排序来评价青稞的氨基酸品质。如表11所示，其中西藏品种的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等综合得分较高，排名靠前，表明这些青稞品种中氨基酸含量较高，具有很好的适应性。

表10 主成分的成分得分系数

3 结论

该研究建立了青稞中氨基酸含量的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法，具有快速便捷、准确度高、操作简单等特点，可适用于青稞等谷物中的氨基酸含量分析。结合主成分分析，评价了不同地区青稞品种的氨基酸含量，结果表明，西藏地区的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等品种在不同地区表现较好，其氨基酸含量较高，具有很好的适应性。

表11 不同品种青稞氨基酸的综合得分和得分排序