米槁果实不同发育时期根际土壤可培养真菌的动态变化

田 秀，黄路婷，谢元贵,3，刘济明，吴婷婷

(1.贵州大学林学院，贵阳 550025;2.遵义市红花岗区林业局林业服务中心,贵州 遵义 563000;3.贵州科学院，贵阳 550001)

【研究意义】米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)系樟科(Lauraceae)樟属常绿乔木，主要分布于中国的西南地区，其干燥成熟的果实是贵州省著名道地药材大果木姜子[1],在治疗胃肠道疾病、心脑血管疾病和风湿关节疼痛方面疗效显著[2]，具有重要的药用价值。根际微生物对植株的生长发育起重要作用[3-4]，研究米槁果实不同发育时期根际可培养真菌，有利于探索其多样性、有益真菌的筛选及有害微生物的防治。【前人研究进展】植物根际是根—土壤—微生物相互作用的热区，也是三者之间进行物质循环、能量交换和信号传递等相互作用的场所[5-6]。根际微生物不仅对植物的养分吸收至关重要，对药用植物有效成分的积累也有一定促进作用[7-9]。童炳丽等[10]利用高通量测序技术研究发现，部分米槁根际真菌类群与药用活性成分呈正相关关系。此外，大量的研究表明，根际微生物的变化与植物的年龄和发育阶段密切相关[11-13]。栀子(GardeniajasminoidesEllis)根际微生物在不同的生育期优势属明显不同，且膨大期微生物多样性最丰富[14]。Lukša等[15]研究表明，沙棘(Hippophaerhamnoides)果实成熟期的真菌多样性明显高于未成熟阶段。【本研究切入点】尽管根际微生物与植物不同发育阶段间相互联系的研究已取得一定进展，但大多数的研究都是基于高通量技术进行，常常忽略传统的纯培养，这严重阻碍了相关功能菌株的开发与利用，难以利用微生物技术实现米槁药材产量和质量提升。目前对米槁研究主要集中于果实化学成分鉴定[16-17]、药理学[18]、化感效应[19]和生理生态[20-21]等方面，而对影响米槁果实发育因素的研究却鲜有报道。【拟解决的关键问题】以米槁果实幼果期、膨大期、成熟期的根际土壤为研究对象，采用稀释平板法分离纯化米槁根际真菌，通过形态学和分子生物学方法鉴定其真菌种类，探究米槁根际可培养真菌群落组成在果实不同生长发育周期内的动态变化规律，为利用其根际有益真菌提高种植药材的品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 米槁根际土壤样品的采集

米槁根际土壤于2019年采自贵州省罗甸县的纳庆村( 26°15′N，106°31′E，海拔790 m)、望谟县的祥乐村(25°10′N，106°5′E，海拔570 m)和坝碰村(25°7′N,106°3′E海拔670 m)。分别于米槁果实发育的幼果期(6月)、膨大期(8月)和成熟期(11月)，每个采样地随机选择5株长势一致且健康的米槁挂果植株，除去地表凋落物和石块等杂物，挖出土表0～20 cm处植株的侧根，用抖落法收集米槁根际土，5棵树的根际土样等量混合后装入灭菌塑封袋，做好标记(时间、地点、编号)，放入冰盒保存带回实验室后立即分离培养。

1.2 真菌的分离、纯化及保存

根际土壤真菌分离采用孟加拉红琼脂培养基,培养基中加入适量青霉素和庆大霉素抑制细菌的生长，减少干扰。菌种纯化采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，菌种采用30%甘油冻存液进行保存。采用稀释平板涂抹法进行土壤真菌的分离，称取10 g新鲜土样，加入至盛有90 mL无菌水的500 mL已灭菌三角烧瓶中，在200 r/min下旋涡振荡30 min充分混匀，稀释为10-3、10-4、10-5浓度梯度接种于孟加拉红琼脂培养基平板上进行涂布培养，每份土样3次重复，于28 ℃暗培养5 d，然后进行分离纯化、计数，随后用无菌牙签将真菌挑出接种到PDA培养基中纯化培养。

1.3 分离菌株DNA的提取、扩增及测序

1.3.1 DNA的提取 刮取PDA上纯化培养14 d的真菌菌丝于无菌离心管中，采用石英砂进行研磨后，按照离心柱型真菌基因组DNA提取试剂盒(百泰克生物技术有限公司)的流程进行提取。

1.3.2 PCR扩增及测序 所用引物为真菌通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(天根生化科技北京有限公司)，进行PCR的扩增并将合格产物送至北京天根生化科技有限公司进行测序。PCR反应体系为50 μL，其中，Master Max(Dye)为25 μL，DNA模板为5 μL，引物ITS1、ITS4均为2 μL，dd H2O为 16 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min，变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环，循环结束后于72 ℃延伸2 min，4 ℃保存，并用1%的琼脂凝胶跑胶检测是否扩增成功。

1.4 菌株鉴定

用透明胶带于近菌落边沿部分粘贴制片、显微镜下观察产孢结构，参考《真菌鉴定手册》[22]对纯化后的真菌进行初步形态学鉴定。随后用测得到的ITS序列导入NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对分析[23]，从结果中挑选与待测菌株序列同源性最高(98%～100%)且已知分类地位的真菌菌株，定义序列相似性≥98%的菌株为相同分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)，根据待测菌株的形态学观察结果和序列分析鉴定待测菌株的种属。

1.5 多样性分析

1.5.1 真菌数量 每毫升样品中菌落形成单位(CFU)=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×10。

1.5.2 相对多度 分离到的某一真菌的菌株数占分离总的真菌菌株数的百分率，用来判定不同根际土壤样品中可培养真菌的优势类群。真菌分离株数为每1 g干土中真菌的菌落数。

每1 g干土中真菌菌落数=同一稀释度3次重复平板菌落数的平均数×稀释倍数/接种量(mL)×(样品含水量)

1.5.3 多样性指数 Shannom-Wiener 指数(H)：H=-∑(Pi)·(lnPi);

Simpson 优势度指数(D)：D=1-∑(Pi)2;

Pielou指数(J)：J=H/lnS;

Margalef 丰富度指数(R)：R=(S-1)/lnN

式中，Pi为第i种的多度比例，可表示为Pi=Ni/N，Ni为属i的单菌落数量，N为根际土样的所有菌株数之和；S为分类单元，为属(种)i所在根际土壤中属(种)的数目；N是总个体数，S代表每个样品的物种总数。

1.5.4 Jaccard(Cj)相似性系数 用于比较米槁果实不同发育期之间根际土壤可培养真菌类群组成的相似程度，判定真菌分布差异程度。

式中，a和b分别为米槁果实不同发育期的土壤根际可培养真菌的物种数或属数,j为两个时期间共有的真菌种数或属数。

2 结果与分析

2.1 米槁果实发育不同时期根际的真菌数量

从图1看出，分离出的真菌数量从高到低依次是膨大期﹥幼果期﹥成熟期，膨大期真菌为幼果期、成熟期的2倍。米槁幼果期根际土壤中真菌数量在纳庆村、坝碰村和祥乐村分别为 1.0×105CFU/g、1.5×105CFU/g和 1.87×105CFU/g，以祥乐村中可培养真菌数量最多；在膨大期，各地可培养真菌数量达到峰值，在纳庆村、坝碰村和祥乐村的根际土壤中真菌数量分别为 2.27×105CFU/g、3.27×105CFU/g和 2.6×105CFU/g，坝碰村中可培养真菌含量远超过祥乐村和纳庆村；成熟期纳庆村、坝碰村和祥乐村的根际土壤中真菌数量分别为 7.67×104CFU/g、1.53×105CFU/g和 8.00×104CFU/g，纳庆村和祥乐村土壤中的真菌数量相差不大，均低于坝碰村。

2.2 米槁果实根际可培养真菌群落组成

从米槁3个发育时期根际土壤中共分离529株真菌，根据菌落生长形态、孢子及菌丝的显微结构进行初步的鉴定，结合内生真菌rDNA-ITS 测序，经BLAST序列比对，鉴定为3门35科57属111种(表1)。在门的水平上，米槁果实根际可培养真菌隶属于子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)及担子菌门(Basidiomycota)。其中子囊菌门有100种，占真菌总种数的90.09%，为优势菌门；在科的水平上，优势菌科为肉座菌科(Hypocreaceae)和发菌科(Trichocomaceae)。

2.3 米槁果实发育不同时期根际可培养真菌组成差异

米槁果实发育3个时期中，幼果期分离真菌分属31属53种(图2)，优势属为丛赤壳属(Nectria，11.90%)、螺旋聚孢霉属(Clonostachys，9.52%)和木霉属(Trichoderma，9.52%)；膨大期共分离真菌36属64种，优势菌属为木霉属(16.99%)、青霉属(Penicillium，16.34%)和丛赤壳属(10.46%)；成熟期分离真菌16属31种，种类明显少于果实幼果期和膨大期，木霉属(41.90%)为绝对的优势属，其次是拟青霉属(16.19%)和螺旋聚孢霉属(8.57%)。随着米槁果实不断成熟，木霉属的相对丰度越来越大，而镰孢属(Fusarium)呈相反的变化趋势。

表1 米槁果实可培养真菌群落组成

续表1 Continued table 1

从图3看出，米槁果实发育不同时期分离的真菌中，幼果期、膨大期和成熟期共有属为8个，分别为丛赤壳属、多胞菌属(Pleosporales)、镰孢属、青霉属、木霉属、螺旋聚孢霉属、曲霉属(Aspergillus) 和拟青霉属；幼果期与膨大期共有2属，与成熟期共有3属，膨大期与成熟期共有4属。米槁果实发育不同时期的特有种中，成熟期21属，幼果期18属，膨大期2属。说明不同果期间米槁根际真菌在物种组成上虽有较大差异，但在主要类群组成上又表现出一定的稳定性。

2.4 米槁根际可培养真菌在果实不同发育时期的多样性

从表2看出，3个不同时期根际可培养真菌群落OTU数、多样性指数(H)、优势度指数(D)、丰富度指数(R)和均匀度指数(J)均表现为膨大期﹥幼果期﹥成熟期。果实膨大期各指数均为最大，幼果期的优势度指数(D)和均匀度指数(J)数值与膨大期相近，成熟期各指数在数值上远小于膨大期与幼果期，说明根际土壤真菌群落组成多样性随着果实发育进程的递进逐渐发生变化，成熟期根际真菌群落多样性最低，物种组成较幼果期、膨大期单一。根据Jaccard相似性原理： 当Cj为0.00～0.25 时为极不相似，Cj为0.25～0.50时为中等不相似，Cj为0.50～0.75时为中等相似，当Cj为0.75～1.00时为极相似。从表3可知，米槁果实发育的3个不同时期，根际真菌群落相似性系数在0.2500～0.5000，幼果期和膨大期为0.2885，幼果期和成熟期为0.3429，膨大期和成熟期为0.3333，说明3个果期间真菌群落组成中等不相似，群落分布存在明显差异。

表2 米槁果实发育不同时期根际可培养真菌群落组成多样性指数

表3 米槁果实发育不同时期根际可培养真菌的相似性系数

3 讨 论

真菌在生态系统中起着重要的作用，能与大多数植物形成共生体，提高植物体对养分的吸收[24]，促进植物的生长[25]。同时，部分病原菌的存在会导致植株感病，降低植物产量，危及植物生存[26]。本研究从米槁根际土壤中共分离出529株真菌，经形态特征和分子鉴定隶属于3门35科57属111种。其中，幼果期真菌数为4.37×105CFU/g，膨大期为8.14×105CFU/g，成熟期为3.10×105CFU/g，表明米槁根际蕴含丰富的可培养真菌，物种多样性较高且菌株数量丰富。子囊菌门(Ascomycota)为优势菌门，这与董林林等[27]对人参根际真菌的研究结果一致。随着米槁果实的发育，根际可培养真菌群落数量及组成存在一定的差异，在幼果期共分离出31属53种，膨大期为36属64种，成熟期为16属31种，优势属及其相对多度明显不同。米槁果实发育初期至成熟的整个阶段，根际可培养真菌数量表现为先增加后降低的趋势，真菌群落多样性指数(H)、优势度指数(D)、丰富度指数(R)和均匀度指数(J)均表现为膨大期﹥幼果期﹥成熟期。膨大期分离得到的真菌数量最多，明显高于幼果期和成熟期，与杜宣延等[28-29]对不同生长期烤烟、大豆根际土中真菌数量动态变化的研究结论一致，这可能与米槁在幼果期和成熟期阶段(6—9月)受病害的严重程度有着紧密的联系[16]。前人研究[30]表明，镰孢属真菌(Fusarium)是导致米槁根腐病和新叶黑腐病的病原真菌。本研究中，镰孢属真菌在幼果期、膨大期远高于成熟期，该病原真菌在这两阶段的大量繁殖可能是导致成熟期真菌数量下降的主要原因之一。其次，从幼果期到成熟期，土壤中营养物质含量逐渐降低，土壤真菌养分供应相对减少，真菌生长繁殖及代谢活性受到一定的限制[31]，成熟期土壤中可培养真菌数量也明显下降。而病原拮抗菌木霉属在成熟期却快速繁殖，为成熟期的绝对优势菌属。

成熟期各多样性指数均低于膨大期与幼果期，可能还与幼果期、膨大期果实自身发育较快地代谢速率有关。8月是米槁生长发育旺盛期[16]，此期温度的上升、降雨量增多更利于真菌孢子萌发与植物根系残体分解。根系分泌物的增加丰富了真菌生长繁殖所需要的营养物质来源，因而膨大期根际真菌种类增加，群落组成较复杂。幼果期、膨大期也是果实的药用成分迅速累积阶段，需根际多种真菌共同参与调节[32]。微生物生存环境的差异影响其群落构成[33]，根据Jaccard 相似性系数结果显示，米槁生长发育不同期间真菌群落组成中等不相似，群落分布存在明显差异。同时研究还发现，在米槁果实各个发育期，根际土壤真菌的优势菌群有所差异，推测这是由于某一类群真菌与土壤某些养分相互偏好性选择的结果[34]。土壤中各养分含量随着果实的成熟发生波动，吸引不同类群的真菌附集于根际周围，诱导优势菌群发生改变。

4 结 论

米槁根际土壤中蕴含着丰富的可培养真菌。分离出来的529株真菌中，包含3门35科57属111种。其中，子囊菌门(Ascomycota，90.09%)为优势菌门，优势菌科为肉座菌科(Hypocreaceae，11.71%)和发菌科(Trichocomaceae，20.72%)，优势菌属为肉座菌科(Hypocreaceae)中的木霉属(Trichoderma，10.81%)和青霉属(10.81%)。在米槁果实不同发育时期，其真菌群落组成存在一定差异，幼果期、膨大期的真菌多样性指数、丰富度指数、均匀度指数都明显高于成熟期。相关性分析表明，不同果期的可培养真菌存在差异，为中等不相似。从米槁根际土壤中分离培养的111种真菌中，木霉属可拮抗植物病原菌，适应性广、抗菌机制多样且抗菌谱广，是米槁果实不同发育时期的共有属和优势属，在成熟期其相对丰度可达41.90%，较大程度地抑制了病原菌镰孢属(Fusarium)的进一步繁殖，在利用其作为米槁生防菌以实现药材产量和质量提升上具有广阔的应用前景。