牛蒡子苷元对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠肝损伤的保护作用

由高飞，唐金鑫，孙 航，刘士伟，李秋阳，徐 萍，于 雷，毕云枫

（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118）

据2019年临床数据统计，我国患糖尿病（diabetes，DM）人数约为1.16亿 人，占总人口的12.8%，随着人们生活水平的改善和不健康饮食习惯的增加，DM患者已经出现早期患病、低龄患病人数增加的趋势。DM患者血糖长期处于较高水平，从而可引发各种并发症，如肝脏、肾脏、血管和心脏相关疾病等，其中肝脏病变率高达21%～78%。当前DM型肝病患者治疗以终身用药为主，不能达到根治，且长期服药会产生多种毒副作用，导致体质量下降。因此寻找高效、低毒的具有保护DM肝脏损伤的天然活性成分已成为当前人们关注的焦点。

牛蒡子是菊科草本作物牛蒡的干燥果实，牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）是牛蒡子中的木质素类成分（质量分数为0.5%～1.0%），可通过酶解或酸水解牛蒡子苷（质量分数5%～7%）制备，ATG可在动物肠道内高效发挥药理作用，研究发现ATG具有抗流感病毒、抗结肠炎、抗DM小鼠肾脏损伤、抗抑郁和抗焦虑、降血压和改善认知障碍等作用，其广泛的药理活性受到研究者的重视。目前鲜见ATG对DM肝损伤的治疗效果研究，因此，本实验研究ATG对四氧嘧啶诱导的DM小鼠肝脏损伤的保护作用，旨在为DM型肝损伤的预防、治疗和ATG相关保健产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级ICR雄性小鼠，80 只、5 周龄，体质量25～30 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司（生产许可证号：SCXK（京）2019-0008）。

嗜热-葡萄糖苷酶由本团队构建的工程菌表达并提取制备；牛蒡子苷（纯度为70%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；ATG（纯度为97.2%）由嗜热-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制备。

二甲双胍（metformin，Met）、四氧嘧啶、羧甲基纤维素钠、组织Toll样受体4（toll-like receptors，TLR4）、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）单抗 北京索莱宝科技有限公司；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（asparate aminotransferase，AST）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）试剂盒 南京建成生物研究所；所用其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JY92-IIDN型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司；2100型可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；LC-MSH-2L型恒温加热磁力搅拌器、Neofuge 23R型台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机有限公司；XL30 ESEM-FEG场发射环境扫描电子显微镜美国FEI公司；Multiskan FC型酶标仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；EA-12型安稳血糖测定仪 三诺生物传感股份有限公司；Flexar型高效液相色谱仪 美国PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 ATG的酶解制备

利用超声波辅助-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制备ATG，根据前期实验结果确定最佳工艺参数为酶用量质量分数3.0%、酶解时间2.5 h、酶解温度60 ℃、超声功率320 W。反应结束后，ATG粗提物经萃取、真空抽滤、脱色、旋转蒸发、水洗去糖、体积分数50%乙醇溶液重结晶处理，真空冷冻干燥收集ATG提取物，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测纯度为97.2%，0～4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 动物饲养

吉林农业大学动物中心第四饲养室，早8∶00至晚8∶00给予光照，温度为23 ℃，相对湿度55%，每笼5 只小鼠，及时添加饲料和水，更换垫料，小鼠采购后适应新环境14 d。实验伦理审查编号：20201110001。

1.3.3 实验相关溶液的配制

溶液配制参考文献[17]中的方法，四氧嘧啶的配制：依据小鼠每千克体质量称取180 mg四氧嘧啶溶于0.3 mL冷生理盐水（0～4 ℃），现用现配，2 min注射完毕；质量分数0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制：准确称取0.300 0 g羧甲基纤维素钠溶于60 mL蒸馏水中，磁力搅拌过夜，锡箔纸包裹，4 ℃冰箱保存备用；Met溶液配制：依据小鼠每千克体质量称取200 mg Met，快速溶于冷生理盐水（0～4 ℃），配制成0.3 mL溶液，混匀；ATG溶液配制：依据各组小鼠每千克体质量相应称取120、90、60 mg ATG，加入质量分数0.5%羧甲基纤维素钠中制成0.3 mL混悬液。

1.3.4 建立四氧嘧啶诱发DM小鼠模型

将适应14 d的小鼠晚10∶00至次日早8∶00断食不断水，腹腔注射180 mg/kg四氧嘧啶，给药3 d后，前一晚断食不断水8 h后，尾尖取血，用血糖仪测血糖浓度，血糖浓度高于11.1 mmol/L作为DM建模标准。选取健康小鼠作为对照组，将DM小鼠随机分组，灌胃给药：对照组、模型组灌胃生理盐水10 mL/kg，Met组灌胃Met 200 mg/kg，ATG高、中、低剂量组分别灌胃120、90、60 mg/kgATG，各给药溶液均为给药前配制，每日早8∶00给药，实验周期为28 d。

1.3.5 常规指标测定

第一次灌胃给药后，每7 d记录小鼠体质量和空腹血糖浓度，观察各组小鼠健康状态。实验结束称量各组小鼠肝质量，根据下式计算肝脏指数。

1.3.6 血清指标测定

灌胃4 周，最后一次灌胃后，将所有小鼠转移至解剖室进行样品的采集，眼球取血1 mL，使血液缓缓自然流下，常温静置1 h，冷冻离心机分离血清（5 000 r/min、10 min），于-20 ℃冰箱备用。按照试剂盒说明书测定ALT、AST活力和IL-6、TNF-α质量浓度。

1.3.7 GSH、CAT、SOD水平测定

将小鼠脱颈椎处死，解剖分离肝脏组织，生理盐水冲洗肝脏表面血迹，称质量、记录，各组取0.200 0 g肝组织，剪刀剪碎后，超声波细胞粉碎机进行冰水浴粉碎，加入适量冷生理盐水，配制质量分数5%的组织匀浆液，冷冻离心（5 000 r/min、10 min）得上清液。依据说明书中小鼠肝匀浆浓度曲线进行预实验，确定最佳的组织样品浓度，按照试剂盒说明书测定GSH、CAT、SOD水平。

1.3.8 肝脏组织病理学分析

取相同部位肝组织，经质量分数4%甲醛溶液固定，脱水、透明处理、包埋后，制备3 μm切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）法染色，于电子显微镜下（400 倍）观察小鼠肝组织病理变化。

1.3.9 蛋白免疫印迹分析

将肝组织冰浴迅速剪碎，倒入蛋白裂解液快速研磨10 min，低温离心（6 000 r/min、20 min）后测定蛋白含量，经过配胶、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、转移、转膜后，充分将样品中相关蛋白条带分离。洗膜：用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）处理5 min，重复3 次（下同）；加入包被液，缓慢摇晃，室温放置2 h，倒掉包被液，再次洗膜；一抗：用0.01 mol/L PBS稀释，覆盖聚偏二氟乙烯膜，室温放置2 h。用1%牛血清白蛋白（质量分数98%）作对照；二抗：加入辣根过氧化物酶偶联，缓慢摇晃，室温放置2 h；倒掉二抗，洗膜；暗光加显色剂，待出现条带，加入双蒸水停止反应。用ImageJ软件进行灰度分析，结果以目的蛋白相对GADPH的表达量表示。

1.4 数据处理与分析

数据表示为平均值±标准差，每组重复3 次，使用Origin Pro 9.0软件作图和SPSS 26软件分析数据，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较分析采用Bonferroni法。以＜0.05、＜0.01分别表示差异显著和极显著。

2 结果与分析

2.1 建模情况分析

四氧嘧啶腹腔注射剂量为180 mg/kg，对于第一次建模未成功小鼠进行第二次半数剂量建模（90 mg/kg），建模成功率为62%。建模后，6 只小鼠死亡，死亡原因有小鼠机体免疫力低下、DM引起的不适和小鼠相互撕咬等，与灌胃ATG无关。小鼠DM症状明显，表现为体毛变得粗糙杂乱、伏地行走、不好动、反应迟缓、垫料潮湿、粪便较多和饮食进水量增加等。

2.2 小鼠常规指标分析结果

空腹血糖浓度能够准确反映出DM小鼠患病状况，由图1可知，与对照组相比，模型组小鼠血糖浓度极显著升高（＜0.01），均超过11.1 mmol/L，结合2.1节小鼠生理状况，证明本实验DM小鼠模型建立成功。在28 d时，与模型组相比，Met组、ATG高剂量组小鼠血糖浓度极显著下降（＜0.01），相比于0 d时，血糖浓度分别降低30.75%、26.12%。

图1 ATG对小鼠血糖浓度的影响（n＝7）Fig. 1 Effect of ATG on the blood glucose level of mice (n = 7)

由表1可知，与0 d相比，28 d时各组小鼠体质量都有不同程度的增长，对照组、Met组和ATG高剂量组小鼠体质量极显著增长（＜0.01），分别增长20.22%、13.47%和11.03%；模型组小鼠体质量增长不显著（＞0.05）。0～7 d时，部分小鼠因注射四氧嘧啶后，机体代谢发生紊乱，体质量会出现负增长，而Met、ATG不同剂量组都能对DM小鼠体质量的下降起到改善作用。

表1 ATG对小鼠体质量的影响（n＝7）Table 1 Effect of ATG on body mass of mice (n = 7)g

如表2所示，与模型组相比，ATG高、中剂量组对肝脏指数作用效果极显著（＜0.01），低剂量组作用效果不显著（＞0.05）。综上所述，ATG可以改善DM小鼠体质量降低、肝脏脂肪堆积的情况，ATG高剂量组与Met组治疗效果相当。

表2 ATG对小鼠肝质量和肝脏指数的影响（n＝7）Table 2 Effect of ATG on liver mass and liver index of mice (n = 7)

2.3 血清指标分析结果

AST和ALT是反映肝脏健康程度的指标，小鼠肝脏在受到药物刺激时，器官内的AST和ALT会通过受损的器官流向组织间隙，进入血液。由图2可知，与对照组相比，模型组ALT活力和AST活力极显著升高（＜0.01），表明DM小鼠的肝器官受到了损伤。与模型组比较，Met组、ATG高剂量组的ALT活力和AST活力均极显著降低（＜0.01）；ATG中剂量组AST活力显著降低（＜0.05），ALT活力无显著变化（＞0.05）。以上结果说明，ATG治疗可改善DM小鼠血清中ALT活力和AST活力。

图2 ATG对小鼠血清AST（A）、ALT（B）活力的影响（n＝7）Fig. 2 Effect of ATG on the activities of AST (A) and ALT (B) in serum of mice (n = 7)

IL-6、TNF-α是引起肝脏炎症的重要促炎因子，通过检测血清中IL-6、TNF-α的水平可以判断肝脏的炎症程度。ATG对DM小鼠肝脏炎症因子IL-6、TNF-α质量浓度的影响如表3所示，相比于对照组，模型组中IL-6、TNF-α质量浓度极显著升高（＜0.01），表明本实验DM小鼠已经出现炎症变化。与模型组比较，Met、ATG所有剂量组IL-6、TNF-α质量浓度均显著降低（＜0.01、＜0.05）。以上结果说明ATG灌胃干预后，可减轻DM小鼠肝脏内炎症反应。

表3 ATG对小鼠肝组织IL-6、TNF-α质量浓度的影响（n＝7）Table 3 Effect of ATG on the contents of IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice (n = 7)

2.4 肝脏匀浆相关指标分析结果

GSH、CAT和SOD水平是评价机体内氧化应激反应的重要指标，能在一定程度反映机体受到外界刺激后体内氧化还原平衡的改善能力。如图3所示，与对照组相比，模型组中GSH含量、CAT活力和SOD活力均出现极显著下降（＜0.01）。与模型组比较，ATG高剂量组中GSH含量、CAT活力和SOD活力不同程度的升高（＜0.01、＜0.05），且对于CAT活力的改善效果与阳性Met组相当，ATG中剂量组CAT活力和SOD活力显著升高（＜0.05）。以上结果表明，ATG对DM小鼠肝脏化应激起到改善作用，能够使GSH含量、CAT活力和SOD活力趋近于正常值，从而改善DM小鼠肝脏氧化应激水平。

图3 ATG对小鼠肝组织GSH含量（A）和CAT（B）、SOD（C）活力的影响（n＝7）Fig. 3 Effect of ATG on the levels of GSH (A), CAT (B) and SOD (C)in liver tissue of mice (n = 7)

2.5 肝脏组织病理切片观察结果

如图4所示，对照组肝组织形态完整清晰，不存在脂肪变性现象，组织细胞被正常红染，细胞均匀，内部浆液清晰可见，中间蓝色为细胞核；模型组小鼠肝脏则表现异常，排列明显疏松不规则，细胞内显示出空泡形态，且有出血现象，说明脂肪已经变性；ATG高、中剂量和Met对肝脏组织损伤有一定的改善作用，细胞内染红面积增大，细胞空泡和出血区域减少；ATG低剂量组肝脏切片区域形态基本与模型组无差异，无明显改善效果。

图4 ATG对小鼠肝组织病理变化的影响Fig. 4 Effect of ATG on histopathological changes of liver tissue in mice

2.6 蛋白免疫分析结果

DM小鼠肝脏中TLR4、MyD88和NF-κB p65电泳表达量和蛋白相对表达量分别如图5、6所示，与对照组相比，模型组中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相对表达量极显著升高（＜0.01），ATG高剂量组和Met组有相似的治疗效果，均可显著降低TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相对表达量（＜0.01、＜0.05）；ATG中剂量组干预效果不显著（＞0.05）；ATG低剂量组中MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量显著降低（＜0.01、＜0.05），但对TLR4蛋白表达无显著降低作用（＞0.05）。以上结果表明，ATG对于DM小鼠肝损伤有一定的治疗作用，且与TLR4、MyD88和NF-κB p65信号通路有密切联系。

图5 TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白电泳图Fig. 5 Electrophoresis profiles of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 proteins

图6 ATG对TLR4（A）、MyD88（B）、NF-κB p65（C）蛋白相对表达量的影响Fig. 6 Effect of ATG on the relative expression levels of TLR4 (A),MyD88 (B) and NF-κB p65 (C) proteins

3 讨 论

ATG是牛蒡子中主要的活性成分之一，其在改善DM及其并发症方面具有广泛作用，研究发现ATG可抑制-葡萄糖苷酶活力，延缓血糖浓度增高，从而达到调节血糖水平的作用，ATG给药后，DM小鼠的尿蛋白量、TNF-α表达量下降，蛋白质的非酶糖化能力受到限制，证实ATG可减轻DM肾病损伤。冯芹等发现ATG可降低DM大鼠血压，增加血管内皮生长因子的表达，改善血小板参数特征，减少血小板的破坏，并可降低白细胞总数，改善DM慢性炎症。基于以上研究结果，本实验表明，ATG能降低DM小鼠血糖浓度、提高其体质量，且能降低炎症因子TNF-α、IL-6的质量浓度。

肝脏损伤是DM最常发生的器官损害之一，肝脏损伤病理过程比较复杂，且可能与体内炎症因子表达、水平改变有关，目前研究的主要发病机理是通过脂质过氧化产物指标表示氧化应激，如丙二醛、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量。氧化应激在1型和2型DM的高血糖症中已有报道，因此被认为是DM并发症发展的中心因素；经四氧嘧啶、CCl、脂多糖等诱导的小鼠机体内的氧化应激水平会发生改变，而过度的氧化应激反应会促进相关炎症因子的释放，如TNF-α和IL-1β，而TNF-α与NF-κB通路的表达有紧密联系，前者可活化肝脏内中性粒细胞使氧自由基外流，进而正反馈激活NF-κB，从而使氧化应激和炎症反应形成循环通路，对肝脏细胞造成损伤；TLR4是NF-κB信号通路中主要表达因子，TRL4信号通路被激活后，从而影响NF-κB通路，激活多种炎性因子表达，发生炎性反应，进而会导致机体组织、器官的损伤。研究发现，脂质过氧化可改变氧化应激水平，从而引起细胞损伤。陈羡人等发现人参皂苷Rg1可明显降低大鼠肝组织TLR4蛋白阳性细胞占比，提高SOD、CAT、GSH-Px活力以及总抗氧化能力，并改善大鼠肝组织结构形态。张韫等发现黄连素可改善2型DM大鼠肝脏氧化损伤，大鼠肝组织的Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px等表达量明显升高，该过程可能是通过Nrf2介导的抗氧化实现的。因此，DM肝损伤可能由于TLR4、MyD88、NF-κB p65诱导的炎性通路被激活，引起下游TNF-α、IL-6等炎症因子表达，进而对氧化应激水平产生影响，加剧炎症发展，引起更严重的组织损伤。

4 结 论

本研究发现ATG给药处理后，与模型组相比，ATG高剂量极显著降低了DM小鼠血清中ALT活力和AST活力（＜0.01）；ATG高、中剂量极显著降低了炎症因子IL-6、TNF-α质量浓度（＜0.01）；ATG高剂量极显著提高了糖尿病小鼠肝脏内CAT、SOD活力（＜0.01），显著提高GSH含量（＜0.05）；ATG高剂量显著降低肝脏内TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相对表达量（＜0.05、＜0.01），以上结果表明ATG干预后DM小鼠氧化应激和炎症因子水平均得到改善，肝脏损伤症状减轻，但其作用机理仍需进一步阐明。由于对DM肝脏损伤仍缺乏有效的治疗手段，因此探讨ATG对DM肝脏损伤的保护作用对开展临床DM肝损伤研究具有重要意义。