茯苓提取物对1型糖尿病小鼠血糖及肠道菌群的调节作用

刘 蕾 ，李海涛 ，郑华月 ，陈 琼

1.南阳医学高等专科学校第一附属医院儿科，南阳 473000；2.郑州儿童医院/河南省儿童医院/郑州大学附属儿童医院内分泌遗传代谢科，郑州 450053

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)全球发病率呈逐年上升趋势，多见于儿童或青少年，且具有不可治愈性，给患者家庭及社会带来沉重的负担[1-2]。临床以胰岛素或二甲双胍等降糖药控制糖尿病患者的血糖水平，而在临床应用中发现低血糖、体质量增加、过敏反应等不良反应可影响治疗进展，探寻不良反应小的药物是临床研究重点[3-4]。中药提取物具有毒性与不良反应小、作用温和等优点，如茯苓具有利水渗湿、健脾宁心之效，其化学成分具有抗氧、降血脂、抗衰老等多种药理作用[5]。另有研究发现[6]，或可通过改变肠道菌群组成来防治T1DM，而有学者在研究茯苓三萜类化合物对肠上皮完整性中发现，其可改善肠道屏障功能[7]。基于此，本研究建立T1DM小鼠模型，用茯苓提取物(poria cocos extract，PCE)等灌胃干预，探讨其降血糖、调节肠道菌群的作用机制，为临床新药研发提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

流式细胞仪(赛默飞世尔科技有限公司，Attune NxT)；德国Applied Biosystems 2720热循环仪。

1.2 试药

PCE(CAS：65637-98-1)购自上海昕凯医药科技有限公司；二甲双胍(国药准字H20174087)购自郑州泰丰制药有限公司；链脲佐菌素(CAS：18883-66-4)购自Sigma-Aldrich(上海)公司；胰岛素(insulin，INS)与胰高血糖素(glucagon，GC)试剂盒均购自广州市进德生物科技有限公司；白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)ELISA试剂盒与CD4、CD25、FOXP3、IL-17A抗体均购自Abcam公司。

1.3 实验动物

昆明种小鼠60只，雄性，SPF级，6周龄，体质量17～22 g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2017-0010，小鼠适应性喂养1周，自由采食进水，保持温度23 ℃～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h交替光-暗饲养。

2 实验方法

2.1 配制链脲佐菌素溶液

将链脲佐菌素在预冷0.1 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH环境4.2～4.5)中溶解，配成20 g·L-1的链脲佐菌素溶液，用滤菌器过滤除菌，避光保存，保证30 min内注射完成。

2.2 建立T1DM小鼠模型[8]

取48只小鼠造模，小鼠禁食不禁水12 h，现配链脲佐菌素溶液腹腔注射，200 mg·kg-1，每日1次，连续3 d，注射完成后，小鼠自由饮水摄食，观察造模小鼠饮水、摄食、排尿等情况。5 d后，采集小鼠尾静脉血，用血糖仪检测小鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)，FPG范围在11.1～25.0 mmol·L-1为T1DM造模成功，弃去未成模小鼠。

2.3 分组与干预方法

剩余12只小鼠作为对照组，造模成功43只小鼠随机分为模型组(11只)、PCE低剂量组(11只)、PCE高剂量组(11只)及二甲双胍组(10只)。造模成功后第2天，PCE低剂量组、高剂量组对应予以PCE 3.0、12.0 g·kg-1灌胃，二甲双胍组予以0.2 g·kg-1二甲双胍灌胃，对照组与模型组均予以5 mL·kg-1双蒸水灌胃，各组干预均为每日1次，连续灌胃28 d。

2.4 观察指标

2.4.1血糖检测仪测定小鼠FPG水平 末次干预后，禁食12 h，固定小鼠，摘除眼球法采血，用血糖仪与医用血糖试纸检测各组小鼠FPG水平。

2.4.2ELISA法检测血清INS、GC水平 采集全血进行离心处理，以3 000 r·min-1，离心5 min，-70 ℃保存，ELISA法检测，加入样品、对照品后37 ℃反应(30 min)，洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应(30 min)，再次洗板，加入显色液，37 ℃显色10 min，加入终止液，15 min读取A值，计算小鼠血清INS、GC水平。

2.4.3HE染色观察小鼠胰腺组织形态学 采血完毕，脱颈处死小鼠，分离出胰腺组织、结肠组织等。甲醛固定胰腺组织，梯度乙醇脱水处理，二甲苯透明、包埋，切片机切片(4 μm)，苏木精染色10 s，自来水冲洗3 min，体积分数为1%的盐酸酒精分化20 s，自来水冲洗15 min，伊红染色5 s；乙醇中脱水，二甲苯透明，中性树胶固片，光学显微镜观察胰腺病理学变化。

2.4.4ELISA法检测结肠组织匀浆炎性因子水平 取结肠组织，每50 mg组织加PBS溶液1 mL，剪刀剪碎，进行超声匀浆，4 ℃以3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，-80 ℃保存，ELISA法检测，进行包被洗涤、上样孵育、加酶标二抗孵育洗涤、加底物液显色、加终止反应液终止反应、450 nm酶标仪测定吸光度值，计算结肠组织IL-10、IL-17质量浓度。

2.4.5流式细胞仪测定结肠组织Th17细胞、Treg细胞比例 取结肠组织，剪成1 mm3的组织块，置于15 mL离心管中，200目过滤网过滤，以3 000 r·min-1离心5 min，洗涤2次，加裂解液稀释，加PBS溶液，以3 000 r·min-1离心5 min，洗涤，调整细胞密度为1×106个·mL-1，将细胞放置于流式管中，以3 000 r·min-1离心5 min，洗涤，PBS重悬，加破膜固定液，室温静置1 h后取荧光抗体加入细胞悬液，避光孵育(4 ℃，30 min)，以3 000 r·min-1离心5 min，反复洗涤2次，用流式细胞仪检测Th17细胞、Treg细胞比例。

2.4.6测定结肠内容物肠道菌群丰度 取小鼠结肠内容物50 mg，提取DNA，NanoDrop Lite超微量分光光度计检测质量浓度，检测结果为一级样本，满足建库要求，选择肠道菌群16 s区域V 4区(基因组)，作为扩增区域，用KAPA公司Hi Fi PCR试剂盒、热循环仪扩增，Bioanalyzer 2100生物分析仪系统建库，数据用Trimmomatic V0.32分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 PCE对T1DM小鼠FPG的影响

5组小鼠FPG水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，模型组、PCE低剂量组、PCE高剂量组和二甲双胍组FPG水平均高于对照组(P<0.05)；PCE低剂量组、PCE高剂量组和二甲双胍组FPG水平低于模型组(P<0.05)；PCE高剂量组和二甲双胍组FPG水平低于PCE低剂量组(P<0.05)；PCE高剂量组和二甲双胍组2组FPG水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PCE对T1DM小鼠FPG的影响

3.2 PCE对T1DM小鼠血清INS及GC的影响

5组小鼠血清GC和INS水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较显示，模型组、PCE低剂量组、PCE高剂量组和二甲双胍组血清GC水平均高于对照组，血清INS水平低于对照组(P<0.05)；PCE低剂量组、PCE高剂量组和二甲双胍组血清GC水平低于模型组，血清INS水平高于模型组(P<0.05)；PCE高剂量组和二甲双胍组血清GC水平低于PCE低剂量组，血清INS水平高于PCE低剂量组(P<0.05)；PCE高剂量组和二甲双胍组2组血清GC及INS水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 PCE对T1DM小鼠血清INS及GC的影响

3.3 PCE对T1DM小鼠胰腺组织形态学的影响

对照组小鼠胰腺组织形态规则，胰岛细胞大小均匀、排列紧密，细胞质无空泡化；模型组胰腺组织形态不完整，胰岛细胞排列疏松，细胞质内空泡明显；PCE低剂量组、PCE高剂量组和二甲双胍组胰腺组织损伤程度有不同程度减轻，胰岛细胞排列相对紧密，空泡逐渐减少，其中PCE高剂量组、二甲双胍组空泡减少更明显。见图1。

注：A.对照组；B.模型组；C.PCE低剂量组；D.PCE高剂量组；E.二甲双胍组。

3.4 PCE对T1DM小鼠结肠组织IL-10和IL-17的影响

5组小鼠结肠组织IL-10、IL-17质量浓度比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，模型组、PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组结肠组织IL-10质量浓度低于对照组，IL-17质量浓度高于对照组(P<0.05)；PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组结肠组织IL-10质量浓度高于模型组，IL-17质量浓度低于模型组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组FPG水平结肠组织IL-10质量浓度高于PCE低剂量组，IL-17质量浓度低于PCE低剂量组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组2组结肠组织IL-10、IL-17质量浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 PCE对T1DM小鼠结肠组织IL-10和IL-17的影响

3.5 PCE对T1DM小鼠结肠Th17细胞和Treg细胞比例的影响

5组小鼠结肠Th17细胞、Treg细胞比例比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较发现，模型组、PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组Th17细胞比例高于对照组，Treg细胞比例低于对照组(P<0.05)；PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组Th17细胞比例低于模型组，Treg细胞比例高于模型组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组Th17细胞比例低于PCE低剂量组，Treg细胞比例高于PCE低剂量组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组2组Th17细胞、Treg细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 PCE对T1DM小鼠结肠Th17细胞和Treg细胞比例的影响

3.6 PCE对T1DM小鼠结肠内容物肠道菌群结构的影响

5组小鼠肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科、拟杆菌门比例比较，差异有统计学意义(P>0.05)；两两比较结果显示，模型组、PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科比例低于对照组，拟杆菌门比例高于对照组(P<0.05)；PCE低剂量组、PCE高剂量组、二甲双胍组肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科比例高于模型组，拟杆菌门比例低于模型组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科比例高于PCE低剂量组，拟杆菌门比例低于PCE低剂量组(P<0.05)；PCE高剂量组、二甲双胍组2组肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科、拟杆菌门比例，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 PCE对T1DM小鼠结肠内容物肠道菌群结构的影响

4 讨论

目前认为T1DM是免疫代谢紊乱疾病，由于自身免疫系统紊乱、单核淋巴细胞浸润胰岛β细胞，导致β细胞凋亡、INS分泌严重不足、血糖升高，机体处于高糖水平，破坏正常生理环境，引发酮症酸中毒、急性感染等严重并发症[9]。但近年研究认为有未知因素触发T1DM，不良饮食是触发糖尿病的重要因素[10]，而肠道菌群或许是触发桥梁[11]，以此为突破点，或可探寻治疗新契机。

T1DM治疗需注重延缓胰腺组织损伤程度，控制血糖、INS等水平，目前使用药物虽可有效降低血糖水平，但不容忽视其副作用。

而近年中药学快速发展，临床发现多种中药有效成分可控制糖尿病病情，如青稞多糖[12]和茯苓、丹参[13]等，且来源广泛，安全性高。其中茯苓作为药食同源药材，药性补而不峻、利而不猛，其提取物包含三萜、多糖及脂肪酸类成分，目前已研究证明[14-15]，茯苓具有抗糖尿病、抗氧化及抗炎等活性。本研究构建T1DM小鼠模型后予以不同干预方式，结果显示，PCE低剂量组、PCE高剂量组FPG和血清GC水平有不同程度降低，血清INS水平有所升高，提示PCE能提高INS分泌，减少GC质量浓度，相应改善机体高血糖状态；且本研究发现，PCE高剂量组小鼠上述指标改善程度优于低剂量组，并与二甲双胍组无明显差异，说明PCE具有剂量依赖性，高剂量PCE能达到与二甲双胍相当的血糖调节效果；本研究进一步通过HE染色结果证实PCE可减轻小鼠胰腺组织损伤程度，综合上述结果分析，PCE中茯苓多糖能促进HepG2细胞葡萄糖消耗，发挥降血糖效果，且三萜类化合物茯苓酸可诱导胰岛素样生长因子1信号转导，延缓小鼠细胞衰老，激发胰岛细胞分泌胰岛素，发挥降血糖效用。

通过文献调研发现，肠道菌群与T1DM关系密切，肠道菌群可代谢饮食难以消化的物质，代谢产物方可被机体吸收，若肠道菌群结构失衡，可影响肠道稳态[16-18]；而肠道组织相对于其他器官，具有高密度免疫细胞，而T1DM机体中Treg细胞可调节炎症反应，延缓T1DM进展，主要依赖IL-10抗炎，Th17细胞及其分泌的IL-17促炎[19-20]，调节免疫炎症与肠道微生物平衡，二者可共同构建肠道屏障，控制T1DM疾病进展。本研究统计与分析免疫炎症与肠道菌群指标发现，建模后Treg细胞比例、结肠组织IL-10与肠道菌群乳酸杆菌属、瘤胃杆菌科比例降低，Th17细胞比例、结肠组织IL-17与拟杆菌门比例升高，小鼠肠道菌群结构失衡，免疫炎症紊乱，而相应干预后，PCE低剂量组、PCE高剂量组及二甲双胍组上述指标均有所改善，且相较于PCE低剂量组，PCE高剂量组小鼠肠道菌群结构恢复及免疫炎症调节水平较佳，可达到与二甲双胍相似的效果，表明高剂量PCE治疗T1DM小鼠，能通过调节肠道菌群结构增加有益菌数量，修复肠道稳态平衡，利于肠道免疫细胞功能恢复，以增强免疫调节，抑制肠道炎症发展，从而缓解病情进展。

综上，PCE可减轻T1DM小鼠胰腺组织损伤、诱导INS释放和降低血糖水平，可能与PCE调节肠道菌群结构和改善免疫炎症状态有关，以此来控制病情进展，降低血糖水平，为临床药物研制提供实验依据。