菜心小孢子培养技术的研究进展

任海龙，周贤玉，孙艺嘉，李光光，江定，张华，戴修纯，张晶，郑岩松

（广州市农业科学研究院， 510308）

菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）又名菜薹，是岭南地区栽培规模最大的特产蔬菜之一，仅广东省每年的栽培面积就在300万亩（20万hm2）次以上。近年来，以宁夏为代表的菜心产业化布局快速发展，使之成为一种全国性的大宗蔬菜，在我国蔬菜生产中的地位越来越重要[1]。菜心主要通过杂交选育的方式获得新品种，选育过程一般需6～8代，相当费工费时，且长期自交还会出现种性衰退现象[2]。整齐一致且生产性能强的杂交菜心品种是当前育种追求的主要目标。应用游离小孢子培养技术获得单倍体，进而加倍成后代完全纯合的双单倍体植株（DH植株），可在短时间内获得纯合、稳定的育种材料，从而大幅度缩短育种年限，并且还能分离得到隐性性状，在创制菜心优良自交系和提高育种效率方面具有明显优势，因而备受关注[3～10]。

1982年Robert[11]首次利用小孢子培养技术，成功获得了甘蓝型油菜的小孢子胚状体及其再生植株。自此以后，游离小孢子培养技术进入了快速发展阶段，国内外已先后将小孢子培养技术应用到油菜[12]、大白菜[13，14]和甘蓝类蔬菜[15]的育种中。 我国在20世纪90年代中期才报道了菜心小孢子培养的研究[16]，相对于其他十字花科蔬菜，菜心小孢子培养的起步晚，难度大，还未有培育出品种的报道。

菜心繁种田

1 菜心小孢子培养的影响因素

1.1 基因型

基因型被认为是影响菜心游离小孢子成胚的首要因素。朱允华等[4]以特早50、青梗菜心和四九菜心（19）为供试材料，分析了影响菜心游离小孢子培养的因素，认为基因型对小孢子培养起着决定性的作用，不同材料间诱导频率差异显著；曾小玲等[5]以11个不同基因型的菜心栽培品种为试材，结果有7个基因型材料获得小孢子胚，且不同基因型诱导形成胚的频率存在显著差异，同样表明基因型是影响菜心小孢子胚发生的重要因素；Wong等[17]进一步研究发现，晚熟类型比早熟类型菜心小孢子的出胚率高。近年来，杨易等[8]和赵艳艳等[9]对不同基因型菜心进行了小孢子离体培养的胚胎诱导研究，结果均表明，基因型是决定菜心品种能否出胚的一个重要因素，不同基因型试材间小孢子胚诱导率具有明显差异。

1.2 生理状态

单核靠边期被认为是小孢子成胚诱导的最佳时期，小孢子发育时期通常需要在显微镜下镜检确定。为了取样方便，Wong等[17]提出花蕾在2.0～2.9 mm时的出胚率最佳；庞强强等[2]研究也发现菜心小孢子发育时期与花蕾和花药外部形态特征密切相关，得出单核靠边期的花蕾纵径3.05～3.39 mm，花萼长3.25～3.46 mm，花瓣长2.10～2.33 mm，瓣萼比为0.63～0.71，花药长2.57～2.89 mm、瓣药比为0.77～0.85，可作为不同材料花蕾最佳取样时期的鉴定指标，为菜心小孢子花蕾的选择提供了依据。

另外，植株生长的环境条件也会影响小孢子胚或胚状体的产量。曾小玲等[5]的试验结果表明，当昼夜气温在12～24℃时菜心胚诱导率较高，夜温低于10℃或日温高于30℃时均不利于菜心游离小孢子的出胚，春季小孢子培养的脱分化能力比秋季高。

1.3 预处理

小孢子培养需要打破配子体原有的发育方向，温度调节是主要手段。朱允华等[4]认为，4℃低温预处理幼花穗可明显提高小孢子胚状体的诱导率；Cao等[16]研究认为，在小孢子培养体系中，将过滤后的菜心小孢子于33℃热激处理1 d，对游离小孢子的膨大至关重要，不进行热激处理或热激处理3 d都会明显抑制小孢子的成胚；Wong等[17]发现，32℃热激处理48 h出胚效果更好。

1.4 培养基及其添加物

菜心小孢子培养中常用的培养基是B5培养基和NLN培养基，B5培养基用于冲洗液，NLN培养基用于胚状体诱导。通常还会添加蔗糖、NAA、6-BA和活性炭等促进小孢子胚胎的发育。当前已发表的菜心小孢子培养基配方如表1。

表1 已发表的菜心小孢子培养基配方

蔗糖浓度为100～170 g/L的NLN培养基是进行菜心小孢子胚诱导的基础培养基。杨易等[8]采用不同蔗糖浓度和激素配比的诱导培养基，对不同基因型菜心进行小孢子离体培养的胚胎诱导，认为不同蔗糖浓度的NLN诱导率差异显著，NLN-10诱导效果最佳，出胚率最高，达30.46胚/皿，在NLN-10中分别添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，能显著提高出胚率，是不加激素NLN-10处理出胚率的1.5倍，但该激素组合对难出胚的试验材料无促进出胚作用，且当6-BA和NAA浓度均提高到0.2 mg/L时，胚胎生长发育受到抑制；赵艳艳等[9]以10个菜心品种为试材进行小孢子培养及体系优化，结果表明，同一基因型在不同培养基成分诱导条件下，添加活性炭对小孢子胚状体诱导率的影响较大，培养基中蔗糖质量浓度为130 g/L时胚诱导率最高，在培养基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以显著提高菜心胚状体诱导率；此外，朱允华等[4]也认为培养基中加入活性炭可改善胚的分化；与固定的蔗糖浓度NLN培养基不同，曾小玲等[5]提出热激培养第1天用170 g/L高浓度蔗糖培养之后转换成含130 g/L蔗糖培养基能显著提高小孢子胚诱导率，同时添加0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促进菜心小孢子诱导成胚，添加0.4 mg/L GA3可显著提高菜心小孢子胚芽诱导率和平均每胚出芽数；顾宏辉等[3]在前人研究的基础上，以早熟菜心品种油青四九为供体材料，认为热激诱导后更换培养液比不换培养液连续培养能明显改善胚状体质量，提高正常胚状体比例；近年，牛刘静等[6，7]在大白菜培养体系的基础上建立了增城菜心和连州菜心的小孢子培养体系，并探讨了细胞器抗氧化剂（VcNa）和植物生长调节剂（BR和TDZ）对小孢子胚胎发生及胚状体再生成苗的影响，认为在NLN-13培养基中添加适宜浓度的BR或TDZ可显著提高连州菜心小孢子胚胎发生率和直接成苗率，扩展了原有小孢子添加物的种类。

2 菜心染色体加倍与植株再生

染色体加倍是培育菜心双单倍体植株的关键。顾宏辉等[3]的研究表明，游离小孢子培养的菜心具有较高比例的自发二倍体（70%）及四倍体（8%），较少的混倍体，这与甘蓝型油菜再生植株的倍性分布相反，可以省去加倍等繁琐步骤，能直接应用于育种研究中。庞强强等[10]对3份不同基因型的菜心研究发现，再生植株的二倍体自然加倍率在62.22%～71.11%，75 mg/L秋水仙素处理可以提高再生株系的二倍体率。

3 存在问题与发展方向

虽然菜心的小孢子培养已经取得了一定的进展，但是目前菜心尚未形成统一的小孢子培养体系，且出胚率和植株成苗率仍然不是很高，体系的重复性和稳定性都不好，致使还未能在育种中应用。如新近发表的文章中，赵艳艳等[9]认为，130 g/L蔗糖浓度NLN（NLN-13）小孢子胚诱导率最高，在培养基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以显著提高菜心胚状体诱导率；而杨易等[8]则认为，100 g/L蔗糖浓度NLN（NLN-10）小孢子胚诱导率最高，130 g/L蔗糖浓度NLN（NLN-13）会明显降低菜心的出胚率，分别添加0.1 mg/L 6-BA和NAA的出胚效果最佳。所报道的菜心小孢子培养体系大相径庭，建议今后应从以下3个方面着手开展工作。

菜心小孢子胚状体和幼苗

①对已报道的菜心小孢子体系进行优化，找到一种适合各菜心基因型的普适型培养体系，使小孢子培养技术得到更广泛的应用。

②在此基础上，进一步简化和完善菜心小孢子培养体系中预处理方式、培养基成分及外源添加物等方案，大幅提高小孢子的出胚率。

③开展菜心小孢子胚胎发育过程和发育途径的基础研究，为完善菜心单倍体育种技术提供理论基础和依据。