干湿交替对南四湖底泥真菌群落影响研究

周冉张志斌张晓蕊孙杰张彦浩

(1.山东建筑大学 市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省环境保护科学研究设计院有限公司，山东 济南 250012；3.山东省金膜再生水资源有限公司，山东 济南 250100)

0 引言

微生物在湖泊底泥的有机物转化、物质循环等方面发挥着重要的作用。微生物群落结构组成是衡量底泥理化性质、功能稳定性和健康状况的重要“指示剂”。水分变化是影响底泥微生物种群结构和微生物对底泥养分利用的重要因素[1-2]。由于真菌类群在抗逆性和恢复力方面存在差异，频繁的干湿交替会引发真菌种群结构的变化，进而可能会影响真菌种群功能变化[3]。刘奎等[4]研究了不同频率、强度干湿交替和不同耕作方式影响下的东北农田黑土微生物的响应，发现干湿交替频率对黑土中微生物的影响高于干湿交替强度。包丽君等[5]通过模拟实验研究了水稻土中古菌种群对干湿交替的响应，表明微生物的重要类群并未因为反复干湿交替而发生较大改变，但古菌的生物量和相对丰度因干湿交替而发生明显变化。目前，有关干湿交替对微生物群落的影响研究主要集中在土壤方面，而关于湖泊消落带底泥干湿交替情况下真菌群落结构的变化研究还鲜有报道。

南四湖是南水北调东线最重要的湖泊之一，是东线调水工程的重要水利枢纽[6]，由于水位波动，其下级湖区大面积的消落带底泥经历频繁的干湿交替。近年来，东线调水导致南四湖水质不时出现氮、磷营养盐波动反弹，这可能与消落带底泥污染释放有关，底泥微生物对干湿交替过程中的营养盐转化起着重要的作用[7-9]。文章采用高通量测序技术[10]分析干湿交替过程中底泥真菌群落的结构变化以及真菌与底泥中理化性质的相关关系，以期为东线调水水质安全提供科技支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年8 月在南四湖消落带区域(北纬34°27′～35°20′、东经116°34′～117°21′)采集0～10 cm表层底泥5 kg，剔除杂草和石块，风干研磨后过4 mm的筛，一部分样品分析底泥理化性质，其余部分用于淹没-落干交替实验。

1.2 实验设计

实验周期设置为120 d。实验期采取淹没(30 d)-落干(30 d)-淹没(30 d)-落干(30 d)交替处理。实验分别在淹没、落干开始第3天和结束前第3天取样，每个周期收集4组样品，共收集8组样品。每次采样取50 g表层底泥于无菌托盘中平均分成两份，一份保存于-4℃，用于测量底泥理化性质，另一份底泥立刻存于-80℃环境下进行高通量测序。

1.3 底泥理化性质测定

底泥样品pH值和氧化还原电位(Oxidation Reduction Potential，ORP)采用电位法测定，总磷(Total Phosphorus，TP)采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法测定，无机磷(Inorganic Phosphorus，IP)和有机磷(Organophosphorus，OP)采用标准化沉积物磷形态分析方法(Standard Measurements and Testing，SMT)进行分级提取，采用干烧法测定底泥中有机质的量，凯氏蒸馏法测定底泥中总氮(Total Nitrogen，TN)的量，总有机碳(Total Organic Carbon，TOC)采用总有机碳测定仪测定。

1.4 底泥真菌多样性的测定

8个样本中微生物群落总脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)的提纯根据E.Z.N.A.Ⓒsoil DNA kit说明书进行，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，采用NanoDrop2000测定8个样本中目的基因条带浓度和纯度；采用ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)对内源转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)区域进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增[11]。每个样品设置3次重复。PCR扩增后得到明亮清晰的基因条带，以便于后续的实验[12]。样品纯化定量后，利用因美纳公司的Miseq PE300平台进行测序[13]。

1.5 数据分析

数据分析采用R语言(version 3.3.1)软件包；使用宏基因组分析软件UPARSE(version 7.1)对序列进行分类操作单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)聚类分析[12]；通过Unite数据库，分析不同底泥样品的真菌在属水平上的种群结构组成；微生物群落结构与底泥理化性质的相关性采用冗余分析(Redundancy Analysis，RDA)相关性分析。

2 结果与分析

2.1 干湿交替过程中底泥真菌多样性分析

利用OTU数量分别定量分析底泥两次干湿交替过程中8个样品的真菌量，结果见表1。在淹没过程中，底泥真菌OTU数量逐渐减少；在落干过程中，真菌OTU数量显著增加，且落干后期的真菌OTU数量较淹没后期多。表明大部分真菌在好氧条件下繁殖能力更强，对干旱环境的抵御能力也更强。通过Alpha分析可以得出底泥中淹没-落干期间真菌群落的丰富度。表1中覆盖率均＞0.99，说明样品中检测到的真菌类群准确反映了样品中真菌丰富度的真实情况。辛普森指数在淹没期间高于落干期间，而香农指数与之相反，表明落干期间的真菌丰富度高于淹没期间；Sobs指数和Chao指数在干湿交替过程中呈降低趋势，表明干湿交替使得微生物丰富度逐渐减少。

表1 干湿交替过程中真菌OTU数量和多样性指数表

2.2 干湿交替过程中底泥理化性质变化

干湿交替过程中表层底泥理化性质变化见表2。干湿交替过程中，底泥pH值淹没后升高，落干后降低，底泥随干湿交替的进行逐渐酸化。ORP淹没后降低，落干后升高。底泥中TOC、TP、OP和IP的变化趋势一致，均在干湿交替的影响下呈缓慢降低趋势，TN的变化不显著。

表2 干湿交替过程中底泥理化性质表

2.3 干湿交替过程中底泥真菌种群变化

底泥样品中真菌种群结构组成差异如图1所示。从结构可知，各个时间阶段的真菌种群既有相似性也有差异性；从数量可知，经过两次淹没-落干的影响，样品中的微生物真菌菌属数量呈减少趋势。通过高通量测序，8个样品中共收集高质量DNA序列566156条，序列长度主要为200～300，平均长度为240。S1、S2、D1、D2、S3、S4、D3和D4中特有菌属 数 目 分 别 为53(19.49%)、10(3.68%)、15(5.51%)、36(13.24%)、10(3.68%)、8(2.94%)、6(2.21%)和5(1.84%)种，共同包含的真菌菌属共有15种。淹没期间，4个样品中共有5个共同菌属，分别是担子菌属(Basidiomycota)、纤维孢子菌(Fibroporia)、金孢子菌属(Chrysosporium)、酵母菌属(Eleutherascus)和粘束孢属(Graphium)；落干期间4个样品中只有1个共有菌属，为节担菌属(Wellmia)。

图1 各底泥样品真菌群落组成差异图

物种组成分析反映了8个样品的群落结构。干湿交替过程中8个底泥样品中的真菌分别属于8个门、26个纲、215个属，如图2所示。在属水平上，8个样品之间底泥中的主要类群是翅孢壳属(Emericellopsis)，占比0.9%～80.0%；支顶孢属(Acremonium)，占比3%～26.7%。

图2 各底泥样品真菌结构图

2.4 微生物群落结构与理化性质的冗余分析

通过冗余分析(通过样点的散集形态，在象限的分布等来反映研究区的特点)对不同样品的微生物群落和底泥理化性质的关系进行分析，如图3所示。对于干湿交替过程中不同阶段样品中微生物群落，有机质(Organic Matter，OM)和ORP对微生物群落的结构影响最大，且两者呈负相关；影响较大的理化性质为TP和pH，两者成正相关；样品中底泥理化性质中TP、pH、OP与OM、TN呈显著负相关。

图3 真菌群落属水平与底泥理化性质的RDA分析图

尽管底泥中真菌的丰度和数量远远少于细菌，但是真菌的呼吸作用却明显高于细菌，说明真菌的营养转化能力在底泥中占有重要地位[14-15]。通过研究红树林消落带沉积物中微生物在生态中的贡献作用，发现腐生真菌是整个微生物网络的关键组成部分，不仅与其他环境变量产生协同作用，甚至决定了整体微生物的群落结构组成，无论是在纵向还是横向的分组中，真菌在环境变量和微生物种群结构变化都发挥了核心作用[16-17]。

在实验中，干湿交替过程中不仅真菌群落结构发生显著变化，而且真菌菌属数量也成逐渐减少趋势。这与刘奎等[4]研究的黑土中微生物群落结构变化与干湿交替相关性分析相似，高频率的干湿交替减少了土壤中微生物的多样性。真菌的群落结构分析表明，在不同时间阶段，翅孢壳属和支顶孢属均为优势菌属且未被命名的菌属占比逐渐增加。未被命名菌属占比的增加表明在实验过程中人为扰动较大。实验初期，翅孢壳属一直占有较高比例且底泥为碱性土壤，而底泥经历两次淹没-落干后，pH值整体降低，翅孢壳属占比减少，表明底泥pH值与翅孢壳属之间相互影响[18-19]。这与IWAI等[20]研究的干湿交替情况下天然盐类土壤中微生物群落结构和土壤理化性质变化的研究结论相似，干湿交替不仅改变了底泥理化性质，同时底泥中的真菌做出了相应的响应。

底泥理化性质是衡量底泥质量的重要指标。研究发现，干湿交替的影响下表层底泥pH值、含水量、ORP等发生变化，干湿交替降低了底泥中的氮、磷，这与郭晨辉等[21]研究的表层沉积物中磷释放对水质产生的影响中，年内水量分配不均增大了区域内表层底泥中磷释放风险的结论一致。ZHAO等[22]在研究澜沧江水位波动引起的土壤退化结果显示，水位波动降低了全氮的量。

湖泊底泥中真菌群落结构受不同理化性质的影响显著不同[23]。实验通过RDA冗余分析发现，干湿交替过程中真菌群落结构与有机质、氧化还原电位的相关性最显著，磷类营养物质和pH值的相关性次之，而总氮的相关性最弱。不同环境理化性质都对微生物产生一定的影响，极大地扩展了微生物群落特征和底泥微生物群落丰度的发展趋势，增加了微生物的多样性[24]。

3 结论

根据上述研究，得到以下结论:

(1)干湿交替改变了底泥的理化性质和真菌的种群结构，真菌物种丰富度呈下降趋势，淹没、落干稳定期间，真菌微生物数量呈上升趋势，稳定的环境有利于微生物的繁殖和生存，频繁干湿交替对环境有破坏作用。

(2)8个样本中微生物群落结构既有相似性，又有差异性，翅孢壳属、支顶孢属为样本中优势菌属。干湿交替会改变底泥真菌的群落结构，干湿交替过程中，翅孢壳属在真菌群落中占比逐渐降低，而未被命名真菌占比逐渐增加。

(3)干湿交替过程中，底泥中pH值、ORP变化显著，OM、TP等物质呈降低趋势，真菌群落结构受OM、ORP和pH的影响最大。