益生菌植物提取物复合生物制剂提高免疫力的应用效果试验

王 诚，王 杰，董桂红，何荣彦，刘 雨，李 燕，王 玲，邢 烛，赵福平，巩 倩，宗 倩，董晓桐

（1.山东健源生物科技有限公司，山东 泰安 271000；2.青岛市即墨区农业农村局，山东 青岛）

益生菌（Probiotics）是一种有取代或平衡生态系统中一种或多种菌系作用的微生物添加物，即通过补充动物消化道内的有益微生物，改善消化道菌群平衡而对动物产生有益作用，迅速提高机体的抗病能力、代谢能力和对饲料的消化吸收能力，达到防治疾病和促进生长的双重作用。

近年来，益生菌的生产和使用量飞速增长，益生菌的使用可减少抗生素的用量，有利于生态平衡。但是，单一的外源性益生菌进入肠道后，复活后往往因为缺乏增殖所需要的营养物质而不能快速的定殖，很快被排出体外，而无法发挥其维持肠道微生态平衡的作用。

植物提取物是指采用适当的溶剂和方法，从植物（植物全部或者某一部分）为原料提取或加工而成的物质。将植物提取物和益生菌组合使用是当前研究的热点，在动物生产中应用效果良好[1]。但是，益生菌和植物提取物的功能复杂多样，不同益生菌、不同植物提取物的免疫激活和调节机制不同。若植物提取物和益生菌组合恰当，其以促进外源性益生菌在动物肠道中定殖和生长，并选择性刺激肠道内源有益菌群的增殖，改善动物肠道微生态群系平衡，提高动物机体的免疫力；但若植物提取物和益生菌组合不当，其不但起不到协同增效的作用，反而有可能还会降低各自的作用。因此，开发高效配伍的益生菌-植物提取物生物制剂仍是当前的技术难点所在。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与试剂 低聚木糖，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和产朊假丝酵母（Candida utilis），均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），其中植物乳杆菌的菌种编号为CICC 21809，枯草芽孢杆菌的菌种编号为CICC 10071，产朊假丝酵母的菌种编号为CICC 1314，紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物均由健源生物科技有限公司提供。无特定病原体（SPF）级雄性Balb/c小鼠，体重18～22 g，SPF级雌性ICR小鼠，18～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。D-hanks液、小牛血清、双抗、胰蛋白酶，乳酸脱氢酶基质液，盐酸溶液，ConA液，MTT，甘油，蒸馏水。

1.1.2 仪器与设备 200目筛网，注射器，96孔细胞培养板，RPM1640不完全培养基，振荡器，酶标仪，天平，超净化工作台，离心机，恒温水浴箱，冰箱，相差显微镜，培养箱，二氧化碳注入泵，萃取器，分离器、压缩机，二氧化碳储罐，冷水机，吸管，玻璃瓶，培养瓶，废液缸，吸头，枪头，胶塞，离心管，加样枪。

1.2 方法

1.2.1 不同益生菌植物提取物复合生物制剂的制备 复合益生菌粉以低聚木糖作为菌粉基质，将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和产朊假丝酵母（Candida utilis）按重量比1:1:1复配，再与菌粉基质混合均匀，制备得到复合益生菌粉。所制备的复合益生菌粉中的总活菌数≥5×108cfu/g。（1）紫花苜蓿提取物由如下方法制备而成：将紫苜蓿全草干燥，粉碎，向粉碎后的紫苜蓿中加入8～10重量倍的乙醇溶液进行回流提取，提取时间2～3 h，提取液回收乙醇后加入氧化铝吸附杂质，过滤，收集滤液，滤液喷雾干燥，即制备得到紫苜蓿提取物。（2）淫羊藿提取物由如下方法制备而成：将淫羊藿粉碎，采用超临界CO2进行萃取，萃取温度为35～40 ℃，萃取压力25～28 MPa、萃取时间2～3 h，收集萃取液；将萃取液冷冻干燥，即制备得到淫羊藿提取物。（3）益生菌植物提取物复合生物制剂的制备及原料组成（按重量份计）：复合益生菌粉2份、紫花苜蓿提取物10份、淫羊藿提取物8份。制备方法：按组方量称取复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物，将其混合均匀，即得。

1.2.2 复合益生菌粉、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母对NK细胞活性的影响 SPF级雄性Balb/c小鼠（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司），体重18～22 g，适应性喂养3 d后，随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组、复合益生菌粉组，植物乳杆菌组，枯草芽孢杆菌组和产朊假丝酵母组；其中复合益生菌粉组灌胃复合益生菌粉组，植物乳杆菌组灌胃菌种编号为CICC 21809的植物乳杆菌菌粉，枯草芽孢杆菌组灌胃菌种编号为CICC 10071的枯草芽孢杆菌菌粉，产朊假丝酵母组灌胃菌种编号为CICC 1314的产朊假丝酵母菌粉，各组菌粉均是低聚木糖作为菌粉基质，活菌数均调整为5×108cfu/g；各组的给药量均为50 mg/kg小鼠体质量，空白组给予相同量的蒸馏水；1次/d，连续灌胃30 d。处死小鼠，无菌取脾，置于无菌Hank′s液中，研磨，经200目筛网过滤，制成细胞悬液。8 600 r/min离心3 s，弃上清后加入Hank′s液清洗并离心，上述过程重复3次。然后调整细胞悬液中的细胞浓度到2×107个/ml，作为效应细胞。选取传代24 h生长良好的YAC-1细胞并调整其细胞浓度到4×105个/ml，作为靶细胞。于96孔板中加入细胞悬液：靶细胞和培养液中各100 μl加入自然释放孔，其余各孔加靶细胞和效应细胞各100 μl。上述各项均设3个平行孔，于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养4 h，然后吸取100 μl上清液置于新板中，同时加入100 μl乳酸脱氢酶基质液，反应10 min后，每孔加入30 μl 1 mol/L的盐酸溶液终止反应，在492 nm处利用酶标仪读取OD值，并按以下公式计算NK细胞活性[2-3]。

1.2.3 复合益生菌粉、紫花苜蓿提取、淫羊藿提取物和益生菌植物提取物复合生物制剂对小鼠免疫机能的影响 SPF级雌性ICR小鼠（购自济南朋悦实验动物繁育有限公司），18～22 g，适应性喂养3 d后，随机分成5组，每组10只，分别为空白对照组、复合益生菌粉组、紫花苜蓿提取组、淫羊藿提取物组和益生菌植物提取物复合生物制剂组，其中复合益生菌粉组灌胃益生菌植物提取物复合生物制剂，紫花苜蓿提取物组灌胃紫花苜蓿提取物，淫羊藿提取物组灌胃淫羊藿提取物，益生菌植物提取物复合生物制剂组灌胃益生菌植物提取物复合生物制剂，各组的给药量均为0.1 g/kg小鼠体质量，空白组给予相同量的蒸馏水；1次/d，连续灌胃30 d。各组均正常饮食、饮水[2-3]。最后一次灌胃后，禁食12 h，测定小鼠体质量，小鼠脱颈处死，并测定各项免疫指标。（1）脾脏和胸腺的脏器指数测定。小鼠脱颈处死后，摘取脾脏及胸腺称质量，按下式计算脏器指数。

脾脏指数（mg•g-1）=脾脏的质量（mg）/体质量（g）；胸腺指数（mg·g-1）=胸腺的质量（mg）/体质量（g）

（2）淋巴细胞增殖能力测定。无菌取脾，置于盛有无菌Hank′s液的玻璃培养皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用无菌Hank′s液洗3次，每次离心（1 000 r/min）10 min，计算活细胞数，调整细胞浓度为2×107个/ml，每孔加入0.2 ml细胞悬液，再加入培养基至1 ml，其中一孔中加入75 μl ConA液（7.5 μg/ml），另一孔作为空白对照，继续培养72 h。培养结束前4 h，弃掉上清液，并加入新鲜的RPM1640不完全培养基，同时加入MTT（5 mg/ml）50 μl，继续孵育4 h。结束后去掉上清液，每孔中加入1 ml异丙醇，震荡溶解后，置于酶标仪上测定吸光度（570 nm）[4-5]。

淋巴细胞的增殖能力=OD加ConA孔-OD不加ConA孔

1.2.4 复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物、益生菌植物提取物复合生物制剂在育雏蛋鸡中的应用 从山东省泰安市某蛋鸡场的育雏蛋鸡中选取部分鸡只进行试验，分成试验1组、试验2组、试验3组、试验4组和对照组5个处理，其中：试验1组是将复合益生菌粉按1 kg复合益生菌粉兑水2 000 kg，制成给药溶液；分别10～14日龄、免疫空白期（21～25日龄）和43～49日龄3个时期以饮水的方式给予上述给药溶液，每次集中4～5 h饮用。试验2组是将紫花苜蓿提取物按1 kg提取物兑水2 000 kg，制成给药溶液；分别10～14日龄、免疫空白期（21～25日龄）和43～49日龄3个时期以饮水的方式给予上述给药溶液，每次集中4～5 h饮用。试验3组是将淫羊藿提取物按1 kg提取物兑水2 000 kg，制成给药溶液；分别10～14日龄、免疫空白期（21～25日龄）和43～49日龄3个时期以饮水的方式给予上述给药溶液，每次集中4～5 h饮用。试验4组是将益生菌植物提取物复合生物制剂按1 kg组合物兑水2 000 kg，制成给药溶液；分别10～14日龄、免疫空白期（21～25日龄）和43～49日龄3个时期以饮水的方式给予上述给药溶液，每次集中4～5 h饮用。对照组在相应时间段给予等量的清水。试验组和对照组的其他饲养条件保持一致。每天统计死淘鸡只的数量，在8周末（第56天）统计鸡只死淘率[6-7]。

死淘率（%）= 死淘鸡只的数量/初始进鸡的数量

2 结果与分析

本研究将复合益生菌粉与紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物复配使用，能同时发挥益生菌和植物提取物的双重作用，达到1+1＞2的效果。其中，复合益生菌粉由植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母复配而成，3种菌株之间有协同增效的作用，能提高NK细胞活性；紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物与复合益生菌粉复配，不仅可以为益生菌提供营养，还可以作为免疫刺激的辅助因子发挥作用，从而显著提高了动物的机体免疫能力。

2.1 复合益生菌粉、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母对NK细胞活性的影响

NK细胞可以非特异性的直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子，从而参与免疫调节增效机体抗感染效应。表1结果表明，与单独使用植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母相比，将上述3种菌株复配后形成的复合益生菌菌粉能显著增强NK细胞活性，可有效增强机体的非特异性免疫功能。

表1 对小鼠NK细胞活性的影响 （%）

2.2 复合益生菌粉、紫花苜蓿提取、淫羊藿提取物和益生菌植物提取物复合生物制剂对小鼠免疫机能的影响

脾脏指数和胸腺指数能够直观的反应动物的免疫功能，由表2可以看出，将复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物进行复配，能显著提高小鼠的免疫功能。

表2 试验结果各处理组的脾脏和胸腺的脏器指数测定结果以及淋巴细胞增殖能力测定结果（mg·g-1）

淋巴细胞的增殖能力是体现T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫反应水平的重要指标，结果表明，与单独使用复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物相比，本研究制备的益生菌植物提取物复合生物制剂能显著提高小鼠淋巴细胞的增殖能力，其效果要优于单独使用复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物的效果之和。

综合上述试验结果可以看出，本研究制备的益生菌植物提取物复合生物制剂能提高动物机体的免疫能力。

2.3 复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物、益生菌植物提取物复合生物制剂在育雏蛋鸡中的应用

育雏蛋鸡的免疫力相对偏低，是鸡疾病的高发期，鸡群的死淘率偏高。表3结果表明，在育雏期饲喂复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物均能在一定程度上降低育雏蛋鸡的死淘率。而将复合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物组合使用后，其降低育雏蛋鸡死淘率的效果更为显著。

表3 对育雏蛋鸡的作用效果

3 讨论

本研究将复合益生菌粉与紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物复配使用，能同时发挥益生菌和植物提取物的双重作用，达到1+1＞2的效果。其中，复合益生菌粉由植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母复配而成，三种菌株之间有协同增效的作用，能提高NK细胞活性，并能生成多种有机酸和酶类物质，抑制肠道内有害微生物的增殖，又可促进有益菌的增殖，形成一个良性循环；紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物与复合益生菌粉复配，不仅可以为益生菌提供营养，还可以作为免疫刺激的辅助因子发挥作用，从而显著提高了动物的机体免疫能力。

如前所述，免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力。免疫机制的异常成为引起各种疾病的原因。因此，开发能够提高机体免疫力的产品将具有十分重要的意义。

益生菌被广泛应用于提高免疫产品，然而其提高免疫力效果仍有待提高，究其原因是没有考虑菌种间的协同与抑制，菌种间的这种关系影响因素包括：菌种的类别、种别以及菌种的配比等。通过菌株复配的方式寻找在提高免疫力方面协同增效作用佳、生物学功能获得拓展的复合菌剂将有利于造福动物和人类健康。

基于此，本研究首先通过菌株复配的方式开发免疫效果协同增强的复合益生菌。

植物乳杆菌是一种重要的肠道有益微生物，植物乳杆菌所起的免疫调节作用与其菌本身和代谢产物有关，甚至死的菌体也有免疫调节作用；其对革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌均有抑制作用，它通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障，并通过其代谢所产生的乳酸、细菌素等物质对其他细菌的作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合，通过拮抗致病菌的生长及其毒素的粘附，阻止其侵入和定植。枯草芽孢杆菌在动物肠道中复苏增殖后可发挥其益生特性，包括改善动物肠道菌群、增强机体免疫力以及提供多种动物所需的酶类等，可以弥补动物体内源酶的不足，促进动物的生长发育，具有显著的益生作用。产朊假丝酵母本身含有丰富的酶类，如单胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶及植酸酶等，这些酶类可以将淀粉、纤维素水解成小分子糖、氨基酸等易被消化和吸收的低分子物质；产朊假丝酵母的细胞壁富含甘露糖和β-葡聚糖等物质，这些物质具有免疫促进剂的功能，能够激发或增强机体免疫功能。

本研究发现，将菌种编号为CICC 21809的植物乳杆菌、菌种编号为CICC10071的枯草芽孢杆菌和菌种编号为CICC 1314的产朊假丝酵母按一定比例进行复配形成复合益生菌粉，其能够提高NK细胞活性，进而显著提高机体免疫力。

天然植物提取物中含有多糖、皂苷、生物碱、精油和有机酸等多种免疫有效活性成分。植物提取物的免疫调节作用是多方面的，其不仅与各种免疫细胞有关，还与细胞因子的产生和活性密切相关。同时天然植物饲料添加剂对免疫系统的影响往往受机体因素及用药剂量的影响，呈双向调节作用，这是植物提取物免疫机理的复杂之处。

紫花苜蓿和淫羊藿所含成分复杂，有效成分和无效成分并存，因此，有效成分和有效部位的富集是制约药物开发的关键环节。本研究对从紫花苜蓿和淫羊藿中提取有效成分的工艺进行了优化，并制备得到了具有提高免疫活性的紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物。

将植物提取物和益生菌组合使用是当前研究的热点，在动物生产中应用效果良好。但是，益生菌和植物提取物的功能复杂多样，不同益生菌、不同植物提取物的免疫激活和调节机制不同。因此，开发高效配伍的益生菌和植物提取物生物制剂仍是当前的技术难点所在。

本研究在获得具有提高免疫能力的复合益生菌粉和紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物之后，尝试将其组合使用，考察复合之后对于动物机体免疫能力的影响。结果发现，紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物与复合益生菌粉复配，不仅可以为益生菌提供营养，还可以作为免疫刺激的辅助因子发挥作用，从而显著提高了动物的机体免疫能力。即复合益生菌、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物三者复配，在提高动物机体免疫力方面具有显著的协同增效作用。