莪术醇提物乳膏通过JAK/STAT3通路对银屑病大鼠皮肤病理改变的影响

姚孝林

（上海朗沁生物科技有限公司，上海 200235）

银屑病是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，临床表现多为鳞屑性红斑。银屑病具有发病率高、病程长、病情反复且难以治愈等特点，再加上瘙痒和疼痛等问题，给患者的身心带来了极大的伤害[1]。目前临床上治疗银屑病的常用疗法有局部治疗、光疗、生物制剂等，但均有明显的不良反应。中医复方治疗具有疗效确切、副作用小等临床优势，在银屑病治疗领域日益受到重视。本研究通过建立银屑病动物模型，研究莪术醇提物乳膏通过Janus 激酶/ 信号转导和转录激活因子（JAK/STAT3）通路对银屑病大鼠皮肤病理改变的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SD 健康大鼠48 只，雌雄各半，由基尔顿生物科技有限公司提供。鼠龄3 ～6 个月，平均（3.81±1.53）个月；体重200 ～250g，平均体重（220.21±7.86）g；饲养温度22℃～25℃，室内湿度35% ～40%。动物室均经过定时紫外线照射消毒。所有动物均给予标准饲料喂养，饲养时间均为1 周。动物可以自由饮水及活动。

1.2 试验药物

莪术来源于四川新荷花中药饮片有限公司。莪术醇提取乳膏的制备：取50g 莪术粉放置于锥形瓶中，加入250mL 甲醇，超声搅拌10 min×3 次，取上清液离心（1500rpm，10 min），再向锥形瓶中加入250mL甲醇，超声搅拌10 min，静置4h，取上清液离心，将2 次离心液合并，用旋转蒸发器回收甲醇，水浴温度45℃。50% 乙醇洗出，水浴蒸发除去乙醇，得到棕红色黏稠液体，即得到莪术醇提取物5.6g[1]。乳膏基质的制备：取单硬脂酸甘油酯70g、硬脂酸140g、白凡士林85g、十六醇20g、羟苯乙酯1g、乙醇8mL，混合加热至70℃，制成油相。将甘油85g、十二烷基硫酸钠10g 溶解于适量的纯化水中，加热至70℃，制成水相，然后将油相缓慢加入水相中，不停搅拌，制成乳膏基质[1]。莪术醇提物乳膏的制备：分多次在莪术醇提物中加入乳膏基质，并搅拌均匀，得到黄色乳膏。然后分别制成两种莪术醇提取乳膏。每克乳膏相当于莪术生药1.0g、2.0g，剂量按原生药g/kg 计算[1]。

1.3 试验方法

1.3.1 分组及制造模型 将48 只大鼠随机分成空白对照组、银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组、莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组，每组12 只。参照魏荣等[2]的研究方法建立银屑病大鼠模型，将所有大鼠背部中间2cm×4cm 区域的毛发全部剔除，然后按照0.05g/cm2的标准将药膏均匀涂抹至已经剔除毛发的区域，空白对照组大鼠毛发剔除区均匀涂抹凡士林乳膏，银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组、莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组大鼠剃除的毛发区域均匀涂抹咪喹莫特乳膏（生产厂家：天方药业有限公司；批准文号：国药准字H20031230），每天1 次，连续涂抹14 d，使其产生银屑病皮损样病理改变。如果在建模过程中大鼠背部的毛发重新长出，则重复进行剃毛处理[1-3]。

1.3.2 给药 建模成功后，空白对照组、银屑病组不作处理，莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组、莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组每天涂抹给药1 次，以覆盖创面为宜。

1.3.3 收集标本 各组大鼠饲养到既定时间，均以颈椎脱位法处死。将大鼠背部皮肤组织分成2 份，其中一份标本在10% 的甲醛溶液中进行固定，经过修块、流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等操作后制备成石蜡切片，测定大鼠背部皮肤损伤表皮厚度、Baker 病理评分、炎症细胞计数，并通过苏木素- 伊红（HE）染色观察病理组织的病变情况；另一份标本置于液氮中冷冻保存，用以后续的指标检测[4]。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 HE 染色及背部皮肤损伤表皮厚度的检测 将制备的大鼠背部皮损组织在10% 甲醛溶液中进行固定、脱水、透明、浸蜡包埋、脱蜡、HE 染色，然后在显微镜下观察大鼠背部皮肤损伤组织的病理学表现，使用IPP6.0 软件测量表皮厚度[2,5]。

1.4.2 Baker 病理评分 Baker 病理评分标准：角质层：出现小脓疡：2 分；角化不完全：1 分；过度角化：0.5分。表层：表层中有颗粒细胞层消失：1 分；棘层肥厚：1 分。真皮层： 毛细血管扩张：1.5 分；出现单一多核细胞浸润，根据严重程度分为重度、中度、轻度，分别计2 分、1 分、0.5 分[1,6]。

1.4.3 炎症细胞计数 Baker 病理评分完成后，使用光学显微镜对大鼠背部皮肤组织进行摄片，采用Imagepro-plus6.0 图像分析系统对所选视野中的炎症细胞进行计数[1,7]。

1.4.4 背部皮肤组织中白细胞介素-17（IL-17）、IL-22、IL-23、γ- 干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平的检测 取液氮冷冻保存的皮肤组织，采用酶联免疫吸附试验检测，将标本用胞被液〔 PH9.5，0.05mol/L 磷酸盐缓冲液（CB）〕适当稀释至30mL，添加至聚苯乙烯反应板孔中，温度4℃，反应24h。第二日使用洗涤剂洗涤3 次，甩干，在各孔中加入稀释液（PH7.4，0.02mol/L，Tris-HCI 缓冲液）稀释的待测标本0.1mL，同时加入阳性和阴性的对照标本，置于43℃下1h。液体除去后洗涤3 次，甩干。在各个孔中加入底物液〔 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4·12H2O35.8 g/L） 〕 5.14 mL、0.05 mol/L 枸橼酸（10.5 g/L）4.86 mL 混匀，加入邻苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30%H2O24.0μL，混匀 0.1 mL，黑暗环境下放置20 min，在各孔中加入 2 mol/L H2SO40.05 mL，终止反应。在酶标仪上读取 A405 吸收值，分析IL-17、IL-22、IL-23 、IFN-γ、TNF-α 的表达水平[2,8]。

1.4.5 背部皮肤组织IL-6 受体/JAK/STAT3（IL-6R/JAK/STAT3）通路因子mRNA 表达量检测 取液氮冷冻保存的大鼠背部皮肤组织，加入 1 mL Trizol 研磨为粉末状，按照制备试剂盒说明书提取大鼠背部皮肤组织中的总RNA，之后对RNA 纯度、含量进行检测，使用Takara 逆转录试剂盒行逆转录处理后获得c DNA，之后使用Prim-er5.0 软件对引物序列进行设计，使用逆转录- 聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测大鼠背部皮肤组织中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表达量，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5 mRNA 表达量[2,9]。

1.5 统计学方法

采用Excel 统计数据，以Graph Pad Prim 6.0 及SPSS 19.0 统计分析作图，计量数据以±s表示，符合正态分布者采用t检验或方差分析，非正态分布者采用Spearman 秩相关分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义[10]。

2 结果

2.1 各组大鼠表皮厚度、炎症细胞浸润数量、Baker评分的比较

由表1 可见，银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组及莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组大鼠的表皮厚度、炎症细胞浸润数量、Baker 评分均明显高于空白对照组，P＜0.05。银屑病组的上述三项评价指标均明显高于两个莪术醇提物乳膏组。此外，莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组的上述三项评价指标均明显低于莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组，P＜0.05。

表1 各组大鼠表皮厚度、炎症细胞浸润数量、Baker 评分的比较（± s，n=12）

表1 各组大鼠表皮厚度、炎症细胞浸润数量、Baker 评分的比较（± s，n=12）

组别 表皮厚度（μmol） 炎症细胞浸润数（个） Baker 病理评分（分）空白对照组 8.31±0.24 31.01±1.23 1.29±0.02银屑病组 78.12±3.24 98.23±24.14 6.55±1.23莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组 52.21±2.34 62.34±6.20 4.63±1.01莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组 45.23±2.08 52.93±4.23 3.25±1.09 t/P 值 54.231/0.001 25.345/0.001 5.136/0.001

2.2 各组大鼠背部皮肤组织中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表达水平的比较

由表2 可见，银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组及莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组大鼠背部皮肤组织中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 的 表 达水平均明显高于空白对照组，P＜0.05。银屑病组的上述评价指标均明显高于两个莪术醇提物乳膏组。此外，莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组的上述评价指标均明显低于莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组，P＜0.05。

表2 各组大鼠背部皮肤组织中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表达水平的比较（pg/g，± s ，n=12）

表2 各组大鼠背部皮肤组织中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表达水平的比较（pg/g，± s ，n=12）

组别 IL-17 IL-22 IL-23 IFN-γ TNF-α空白对照组 1.72±0.01 3.12±0.26 5.68±0.25 17.23±4.23 69.02±12.34银屑病组 2.98±0.27 5.31±0.26 8.23±1.02 38.82±6.82 182.16±20.12莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组 2.56±1.04 4.01±0.59 7.23±0.92 30.32±4.23 140.24±21.01莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组 2.01±0.19 3.31±0.13 6.99±0.78 27.72±4.21 131.01±10.23 t/P 值 1.023/0.001 2.047/0.001 3.245/0.001 13.931/0.001 56.234/0.001

2.3 各组大鼠背部皮肤组织中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA 表达水平的比较

由表3 可见，银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组及莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组大鼠背部皮肤组织中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 的表达水平均明显高于空白对照组，P＜0.05。银屑病组的上述评价指标均明显高于两个莪术醇提物乳膏组。此外，莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组的上述评价指标均明显低于莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组，P＜0.05。

表3 各组大鼠背部皮肤组织中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表达水平的比较（± s，n=12）

表3 各组大鼠背部皮肤组织中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表达水平的比较（± s，n=12）

组别 IL-6R JAK1 STAT3 CD80 CCL5空白对照组 0.21±0.02 0.15±0.02 0.18±0.02 0.01±0.01 0.34±0.06银屑病组 0.34±0.12 0.31±0.07 0.31±0.07 0.22±0.04 0.59±0.13莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组 0.31±0.14 0.28±0.02 0.28±0.03 0.18±0.02 0.52±0.17莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组 0.27±0.02 0.24±0.03 0.25±0.01 0.13±0.03 0.46±0.01 t/P 值 0.025/0.001 0.027/0.001 0.019/0.001 0.124/0.001 0.863/0.001

3 讨论

银屑病是在遗传或环境等因素的刺激下，由免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其病程长，易复发，难根治。此病患者的临床表现多以鳞屑、红斑为主，病变多发生于头皮、四肢伸侧，严重影响患者的身心健康。目前银屑病的发病机制还不明确，但发病群体多为人类。因此理想的动物模型对研究银屑病的发病机制及治疗方案至为重要。本文通过建立大鼠银屑病模型，探索莪术醇提物乳膏对银屑病皮肤病理改变的影响。实验结果显示，银屑病组、莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组及莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组大鼠的表皮厚度、炎症细胞浸润数量、Baker 评分、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表达水平、IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表达水平均明显高于空白对照组，P＜0.05。银屑病组的上述评价指标均明显高于两个莪术醇提物乳膏组。此外，莪术醇提物乳膏（2 g/kg）组的上述评价指标均明显低于莪术醇提物乳膏（1 g/kg）组，P＜0.05。分析本实验结果可知，银屑病典型的组织病理学表现主要为角化过度或不全，炎症细胞浸润。有研究表明，银屑病患者的相关因子，如IL-17A、IL-17F 及IL-23R都是受到STAT3 转录激活，STAT3 是银屑病治疗中的重要靶点之一[11]。莪术醇提物乳膏可能通过激活JAK/STAT3 信号传导通路来发挥降低相关炎性因子表达水平的作用。

综上所述，莪术醇提物乳膏对银屑病皮肤病理改变有明显改善作用，其作用机制可能与细胞因子以及免疫表达相关。