夏科雷登结晶与慢性鼻窦炎的相关研究进展

李莉，杨立新，周宁

作者单位：1安徽理工大学第一附属医院耳鼻喉科，安徽 淮南 232000；2蚌埠医学院研究生院，安徽 蚌埠 233000

夏科雷登结晶（CLCs）是由半乳糖凝集素-10（gal-10）形成的蛋白质晶体，主要由活化的嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞以及一些T细胞产生，也是人类嗜酸粒细胞中含量最高的蛋白质之一。其广泛存在于哮喘、嗜酸粒细胞增多综合征、变应性鼻炎、慢性鼻窦炎（CRS）等嗜酸性疾病中，是导致疾病的直接原因之一，因而成为嗜酸粒细胞类疾病治疗的靶点。这一发现为慢性鼻窦炎的治疗提供了新的思路。本文就夏科雷登结晶的研究进展及对慢性鼻窦炎诊断、治疗的意义作一综述。

1 夏科雷登结晶的发现

1853年，Jean-Martin Charcot首次在白血病病人的脾脏和心脏血液中发现了一种细长的双锥体六角形晶体，1872年，Ernst Viktor von Leyden也描述了哮喘病人痰液中的类似晶体，因而被命名为夏科雷登结晶（CLCs）。当时对于CLCs的性质和意义并不明确。CLCs曾被错误地认为是溶血磷脂酶，随后有学者通过评估其在外周血嗜酸粒细胞和嗜酸粒细胞系（AML14.3D10）中酶的活性发现CLCs的多肽链与任何已知的溶血磷脂酶或其他脂解酶均无相似之处，CLCs不是嗜酸粒细胞性溶血磷脂酶，而是以新型的结构方式结合溶血磷脂酶抑制剂［1］。陆续有研究发现，CLCs蛋白基因的氨基酸序列和三维结构类似于半乳糖凝集素（gal），其碳水化合物识别结构域（CRD）与gal同源且有高度相似的重叠，因此CLCs晶体蛋白被重新命名为Gal-10［2］。通过人类基因组计划，CLCs蛋白基因被精确地定位到人的19q13.2号染色体上。目前的研究发现，Gal-10可存在于人类嗜酸粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞和T细胞亚群中［3-6］，较多的报道和研究集中在人类嗜酸粒细胞中。

2 CLCs的形成及病理机制

体内CLCs的存在与嗜酸粒细胞溶解有关［7］。细胞溶解代表ETosis的发生［8-9］，这是一种活跃的非凋亡细胞死亡过程，可以释放出网状染色质结构［8，10］。ETosis代表一种最初在人类中性粒细胞中发现的自杀性细胞死亡的过程（即NETosis）。在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）-氧化酶复合物产生的活性氧（ROS）作用下，中性粒细胞细胞核解聚，细胞内膜崩解，核与细胞质成分混合，最终，质膜破裂释放中性粒细胞胞外杀菌网络（NETs）以捕杀细菌、真菌和寄生虫等，这种特殊的细胞死亡途径被称为NETosis。NETs由染色质（组蛋白和DNA）和颗粒蛋白组成［11］。嗜酸粒细胞ETosis（EETosis）与NETosis类似。嗜酸粒细胞是源自骨髓的终末分化粒细胞。从血液进入组织后，未活化的嗜酸粒细胞发生凋亡，活化的嗜酸粒细胞发生NADPH-氧化酶依赖性ETosis，释放完整的游离颗粒、gal-10、CLCs、胞外囊泡（EVs）、胞外诱捕网（ETs）和其他细胞内报警蛋白，从而加剧组织的损伤。后续的研究也证实了EETosis导致CLCs形成的假说［12］。Gal-10不存在于分泌颗粒中。在活的嗜酸粒细胞中，Gal-10偏心地位于外周细胞质中［13-14］，在EETosis的过程中，Gal-10在细胞质中均匀地重新分布，与核的形状变化一致，随后形成细胞内CLCs［12］，延时成像显示，一旦细胞内结晶开始，相对较小（＜10 μm）的CLCs会在1～2 min内累积，最后，质膜破裂并出现细胞外CLCs。由此可以得出，活化的嗜酸粒细胞发生ETosis，Gal-10在细胞质中定位变化导致细胞内CLCs的形成，质膜裂解后释放的游离Gal-10和胞内形成的CLCs促进了细胞外CLCs的形成，CLCs的形成取决于Gal-10的浓度。Gal-10可存在于细胞核、细胞质、细胞膜碎片、颗粒和细胞周质中。人类外周嗜酸粒细胞的免疫荧光显微镜检查显示，有大量的Gal-10集中在细胞核中［15］，最近对Gal-10的研究表明，带有增强绿色荧光蛋白（EGFP）标记的凝集素主要分布在HeLa细胞核中，表明Gal-10可以主动转运到细胞核中［16］。这也暗示Gal-10可能通过与未知配体的相互作用来调节转录或翻译。关于CLCs是否仅由EETosis产生尚没有定论。

目前关于Gal-10的体内分子作用机制尚不十分明确。已知Gal-10对T细胞有抑制作用，Gal-10可以与T细胞膜上的未知聚糖结合，从而下调T细胞功能。最新的研究表明［17］CLCs与其他晶体（例如尿酸和胆固醇晶体）类似，可以激活Nod样受体蛋白-3（NLRP3）炎性小体，并在体外被人类巨噬细胞摄取后引起白细胞介素-1β（IL-1β）驱动的炎症。Persson等［12］通过将体外合成荧光CLCs注入到小鼠模型体中的方法，得出CLCs可以激活先天性（仅在结晶状态下）和获得性免疫反应，且其诱导的2型免疫是T细胞依赖性的。遗憾的是目前为止尚没有内源性形成CLCs的哮喘动物模型。关于Gal-10是如何导致嗜酸性炎症的以及其细胞配体、转移运输途径、在信号传导中的作用等仍然是悬而未知的事情。

3 CLCs与慢性鼻窦炎的关系

来自人体或异物的刺激信号可能会触发大量嗜酸粒细胞释放Gal-10，从病原体和寄生虫释放的有毒物质也可能诱发嗜酸粒细胞凋亡或坏死从而产生CLCs。当大量的Gal-10相互作用时，他们可以在很短的时间内形成CLCs。因此，CLCs的形成与嗜酸粒细胞性疾病有关，表明CLCs可用作这些疾病的潜在标志物［18］。随着研究的进展，学者们证明了在各种病理条件下，于组织、体液等嗜酸粒细胞浸润部位均观察到了CLCs/Gal-10（表1）。慢性鼻窦炎（CRS）病人的黏膜、分泌物及气道中存在大量的嗜酸粒细胞。嗜酸粒细胞的分泌颗粒中含有许多丰富的蛋白质，例如嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）、嗜酸性细胞过氧化物酶（EPX）、主要的髓鞘碱性蛋白（MBP-1、MBP-2）和嗜酸粒细胞来源的神经毒素（EDN）。这些高度阳离子的蛋白质不仅对病原体有直接毒性，对组织也有毒性。它们通过破坏脂质双膜的完整性，发挥神经毒性、核糖核酸酶活性，并参与活性氧化剂和自由基的生成［19］，因而被视为嗜酸粒细胞类炎症和疾病如嗜酸粒细胞性慢性鼻窦炎伴鼻息肉（ECRSwNP）的生物标志物，但不是药物治疗的靶点，而嗜酸粒细胞来源的CLCs可能直接导致疾病，成为嗜酸粒细胞类疾病诊断和治疗的靶点［12］。

表1 与CLCs/Gal-10有关的疾病

Gal-10的mRNA水平已被证明是体外人全血中CRTH2活化的标志物［33］。张罗等通过logistic回归分析与受试者工作特征（ROC）曲线得出基于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的CLCs mRNA水平可以作为鉴定ECRSwNP的可靠和替代方法（AUC=0.95）［34］。随后其所在的团队［35-36］通过对CRSwNP病人术后随访，发现与未复发的病人相比，复发病人的鼻分泌物中CLCs浓度及CLCs mRNA水平均显著增加，得出鼻分泌物中CLCs浓度及其mRNA水平可作为预测复发的非侵入性指标。目前诊断ECRSwNP的金标准是组织病理学检查，然而此为有创操作，不利于日常诊疗，鼻腔分泌物中CLCs作为一种无创检查，简便快捷，值得大力推广使用。

通过调查CRSwNP病人鼻分泌物中CLCs浓度对糖皮质激素反应的预测意义［37］，张罗的团队发现鼻分泌物中的CLCs浓度与糖皮质激素治疗反应相关，并且糖皮质激素治疗可显著降低CLCs浓度，由此得出结论：鼻分泌物中CLCs的浓度可以预测CRSwNP病人对糖皮质激素治疗的反应。鼻息肉组织中性粒细胞增多、血清淀粉样蛋白A（与高密度脂蛋白相关的载脂蛋白）水平升高、黏蛋白4的上调、黏蛋白1的下调、白细胞介素-25（IL-25）均与糖皮质激素抵抗有关，可以预测CRSwNP病人对糖皮质激素治疗的反应，与以上指标相比，CLCs的简便易得是个不可忽略的优点，在临床实践中常规使用这种生物标志物，可能会在将来为CRSwNP病人提供更好的糖皮质激素治疗策略。Persson等［12］通过使用无佐剂的Gal-10晶体免疫非洲驼得到3种治疗性单克隆抗体：1D11、4E8及6F5抗体，并通过实验得出这些抗体可以溶解源自CRSwNP病人黏液样本中的CLCs以及哮喘小鼠模型气道内的外源性重组Gal-10晶体，抑制了CLCs诱导的气道炎症、粘液的产生、杯状细胞化生等，为CLCs导致的嗜酸性疾病的治疗提供了新的方向。但是目前，研究尚停留在基础实验阶段，是否可以通过清除CLCs来缓解CRSwNP病人的病情，仍有待考证。

有研究表明嗜酸粒细胞的ETosis与疾病的严重程度有关［24］。那么是否可以通过某种途径抑制EETosis的发生或者阻断其信号转导途径从而减少CLCs的生成来减轻病情？已知在嗜酸粒细胞中，包括钙离子载体，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐，伴随有白细胞介素-5（IL-5）或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的血小板活化因子（PAF），免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白A（IgA），自身抗体和真菌在内的各种刺激均可诱导快速（30～180 min内）EETosis［8，38-42］。添加包括血浆和红细胞分解产物在内的物质可以防止CLCs的形成［8］。这些理论因素是否可以影响人体内源性CLCs的含量以及如何转换为实践因素去指导有关疾病的治疗，可能是日后研究的方向。

4 总结

综上所述，CLCs广泛存在于哮喘、CRS等嗜酸性疾病中，可作为嗜酸性疾病的生物标志物。在最近的研究中发现CLCs可以作为CRSwNP预测诊断、复发及治疗的标志物。CLCs取材简便，若能应用于临床将极大便利临床诊疗工作，前景可观。目前的研究进展显示，CLCs的产生与EETosis有关，然而目前关于Gal-10的体内分子作用机理并不完全清楚，仍需要广大学者继续努力。