孔雀石绿的快速检测产品评价研究

潘玉宁，林 慧，薛 瑾，孙彦敏，陶 飞，颜春荣，徐春祥

(江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210008)

孔雀石绿(malachite green,MG)是有毒的、人工合成的三苯甲烷类化合物，既是染料也是杀灭真菌、细菌、寄生虫等的药物[1]，因其价格低、抗菌广、药效稳等特点曾被广泛应用于水产品养殖和运输过程中[2-7]。孔雀石绿在动物体内被吸收后可迅速代谢成隐色孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)，且在动物体内代谢消除速率低，并长期富集残留于组织中[8]，人类长期食用可产生致癌、致畸、致突变等副作用[9-10]，目前已被国家明令禁止添加[11]，但仍有少部分不法商贩在违规使用[12]。

目前MG、LMG的实验室检测方法主要有液相色谱法或者液相色谱-串联质谱法等[13-17]，虽然可用精确定量检测，但前处理时间较长、过程较为繁琐、检测成本较高，所以无法满足水产品流通市场的监管需求。国家食品药品监督管理总局(以下简称国家食药总局)发布了快检方法《水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法(KJ201701)》[18]，该方法比仪器方法更简单，成本也低。但相关的快检试剂盒产品的监管和应用仍处于初级阶段，在实际使用过程中仍存在很多问题。

国家食药总局发布了《关于规范食品快速检测方法使用管理的意见》(食药监科〔2017〕49号)[19]及《食品快速检测方法评价技术规范》(食药监办科[2017]43号)[20]，强调应严格控制快检产品质量，对快检产品的评价指标(灵敏度、特异性、假阴性率和假阳性率、与参比方法一致性分析)、评价方法、评价步骤、评价结果及报告出具等方面提出了具体要求。基于此，笔者所在单位正式调研各地市使用孔雀石绿快检产品的使用情况，结合我省实际情况，主要针对国家已发布的《水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法(KJ201701)》[18]中的相关产品，通过使用单位、经销单位以及邀请部分地区拟采购相关快检厂家提供产品的方式，获得了5个厂家的快检产品，对产品的灵敏度、特异性、假阴性率和假阳性率、与参比方法一致性分析等方面作出评价，以期为食品快速检测产品的评价工作提供技术参考，为全面支撑食品监管和服务快检高质量发展打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8050型三重四级杆液质谱联用仪，日本岛津公司；XS-205DU型电子分析天平，美国梅特勒-托利多公司；MILLI Q型超纯水仪，美国Millipore公司；Beckman Avanti JXN-6型离心机，美国Beckman公司；IKA VORTEX4型涡旋混合器，德国IKA公司。

孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准品(纯度≥99.0%)，德国DR.E公司；同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)(纯度≥99.0%)，德国WITEGA公司；乙腈、甲醇(色谱纯)，美国Thermo Fisher公司；无水乙酸铵、冰乙酸、二氯甲烷(分析纯),美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、氘代孔雀石绿、氘代隐色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100 μg/mL的标准储备液，-18 ℃避光保存，临用现配。

1.2.2 评价用样品制备

1)空白(阴性)样品的制备。市场上购置青鱼，去鳞去皮后沿脊背取肉，按照文献[21]液相色谱-串联质谱法确定孔雀石绿和隐色孔雀石绿为未检出后，确定为空白(阴性)样品，-18 ℃保存。

2)评价用盲样的制备。按照文献[20]提出的要求，本评价设置4个水平(0、1、2和4 μg/kg)的样品，涵盖孔雀石绿快检产品方法标称检出限(2 μg/kg)的0、0.5、1和2倍的4个水平的盲样，每个水平样品数量为50份。

1.2.3 孔雀石绿稳定性实验

有研究[22-23]表明孔雀石绿在无催化剂的条件下有光降解特性，且光照能促进孔雀石绿降解。本次评价实验前期，配制了10 μg/L的孔雀石绿溶液于透明三角烧瓶中。在晴天时，从早上8时开始，在自然日照条件下室外直射(室外气温为23～28 ℃)，光照时间0、2、4、6和8 h，按照文献[21]中液相色谱-串联质谱法分别检测其中孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。选取不含孔雀石绿和隐色孔雀石绿的鱼肉为基质，制成6个样品，在其中添加10 μg/kg 的孔雀石绿溶液，按照同样的光照时间、同样的检测方法检测其中孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量。

1.2.4 隐色孔雀石绿添加回收实验

本次评价采用不含孔雀石绿和隐色孔雀石绿的鱼肉为基质，每3个样品为一组，每组样品中分别添加1、2和4 μg/kg 3个水平的隐性孔雀石绿，参照文献[21]方法，对上述9个样品进行检测，计算隐色孔雀石绿在鱼肉基质中的添加回收率。

1.2.5 盲样的均匀性和稳定性试验

对于盲样均匀性考察，从前述的1、2和4 μg/kg 3个水平样品中分别随机抽取10个样品，每份样品称取2份样，采用液相色谱-串联质谱法进行检测，采用单因子方差计算F值，分析验证样品的均匀性。根据文献[22]中要求，若F0.05(9,10)<3.02(临界值)，表明在0.05显著水平时，样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。对于盲样的稳定性考察，在各水平的样品中选取6个样品，每个样品分成2份样品：第1份样品按照液相色谱-串联质谱法进行检测(n1，第1次检验测量的测量次数为6)，第2份样品在-20 ℃放置5 d后用同样的方法进行检测(n2，第2次检验测量的测量次数为6)。根据GB/T 15000.5—1994要求，采用t检验[23]对2次测定的平均值进行分析，若t

1.2.6 快检产品评价

本次评价采用的快检产品来自A、B、C、D和E这5个厂家。参照文献[20]，将0、 1、2和4 μg/kg 4个水平的样品各50批按照1～200随机数排布编码。不同组给予A～Z组号，每组随机号随机产生，形成不同组的盲样。样品测试前，不同厂家采用抽签形式抽取相应组别。保证双盲实验。按照文献[20]的要求进行各个厂家产品的评价实验，从产品的性能指标(灵敏度、特异性、假阴性率和假阳性率)、与参比方法一致性分析对产品做出评价，按照规定中的快检产品性能指标计算表得出各个厂家产品的性能指标，考察各产品的样品前处理操作难易程度、检测时间与检测成本、辅助仪器设备、结果判定、适用性等。

1.3 液相色谱-串联质谱法仪器条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相为流动相A 10 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水和流动相B乙腈，梯度洗脱程序见表1；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；离子源为电喷雾电离(ESI)；扫描模式为正离子；扫描方式为多反应监测(MRM)；喷雾电压为3 500 V；质量分析器为三重串联四级杆质谱(QQQ)；辅助气流速为 3 L/min；加热气流速为10 L/min；干燥气流速为10 L/min；接口温度为300 ℃；脱溶剂管温度为250 ℃；加热模块温度为400 ℃。监测离子对信息见表2。

表1 梯度洗脱程序

表2 监测离子对信息

2 结果与讨论

2.1 产品外观及检测步骤对比分析

各个厂家快检产品的包装、说明书、标签标识、配套试剂等查验，结果如表3所示。由表3可知：所有产品外包装完整，所有产品标签和说明书完好。各厂家称样量略有差异，3～5 g不等。厂家D和E快检产品标称检测时间均为40 min，厂家A、B、C均为60 min。5个厂家产品的操作步骤均分为提取、氧化、浓缩、复溶及滴卡判定5个步骤。在判读时，D采用的是试纸条显色，其余A、B、C、E均为检测卡。判读方式上，A、C采用机器判读方式，其余3个厂家采用人眼判读方式。5个厂家的标称检出限均为2 μg/kg。这5个厂家产品标称的操作时间、操作简便性、检出限满足市场监管及实际使用时对快速检测产品的实验操作要求。

表3 试剂盒产品外观及标示情况

2.2 孔雀石绿稳定性

孔雀石绿的稳定性实验结果如图1所示。由图1可知：随着光照时间的处长，孔雀石绿溶液中孔雀石绿的含量逐渐降低，隐色孔雀石绿的含量逐渐增加；在光照4 h时，孔雀石绿含量为4.35 μg/kg，含量下降56.6%，且实验发现部分孔雀石绿转化为隐色孔雀石绿。在光照条件下，鱼肉基质中的孔雀石绿也出现了类似的降解趋势，最终光照8 h后样品中的孔雀石绿含量仅为2.1 μg/kg。张彤晴等[24]的研究结果同样表明太阳光有降解孔雀石绿的作用，且孔雀石绿有部分转变为隐色孔雀石绿。为确保评价实验的有效性，本次评价实验仅使用添加隐色孔雀石绿的样品为盲样。

图1 不同光照时间的孔雀石绿溶液中孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量变化Fig.1 Changes of malachite green and leucomalachite green content in malachite green solution with different sunshine time

2.3 加标回收率

本次评价参照文献[21]方法，验证隐色孔雀石绿在鱼肉基质中的添加回收率，仪器条件参照1.3节。各水平的添加回收率结果见表4。由表4可知，结果符合评价要求。

表4 鱼肉基质隐色孔雀石绿添加回收实验结果

2.4 盲样的均匀性实验结果

根据文献[22]要求测定盲样中隐色孔雀石绿的含量后，添加1、2和4 μg/kg水平的盲样中隐色孔雀石绿的F0.05(9,10)分别为1.982、0.973和0.738，均小于3.02，表明在0.05显著水平时样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。

2.5 盲样的稳定性实验结果

通过查得文献[23]附录，t0.05(10)=2.23，孔雀石绿在添加水平为1、2和4 μg/kg计算的t值分别为3.941、4.032和3.017，均大于t0.05(10)(2.23)，显示孔雀石绿在样品中不稳定，无法满足本次评价实验要求。而隐色孔雀石绿在添加水平为1、2和4 μg/kg计算的t值分别为1.121、0.837和0.671，均小于t0.05(10)(2.23)，表明制备的隐色孔雀石绿盲样在-20 ℃放置5 d后，盲样是稳定的，因此在盲样制备后5 d内完成评价实验。

2.6 评价结果

2.6.1 试剂盒实际检测完成时间及操作情况

在实际操作过程中，10批次检测情况如表5所示。由表5可知：C厂家操作用时最短，10批次用时约27 min，A厂家次之，约31 min，B、D厂家用时约36 min，E厂家用时最长，约40 min。操作简便程度上，C与E厂家在样品前处理操作步骤上最为简便，仅需三步提取一次离心，比其他4个厂家产品简便一些，A厂家次之，D最为复杂，需4步提取、2次离心。A、B、C、E均在处理中吸取上清液进行检测，操作较为简便，D厂家需吸取下清液，操作难度略大。

2.6.2 灵敏度

评价结果分析统计计算公式参照文献[18，20]进行。规定中要求孔雀石绿快速检测试剂盒的性能指标的灵敏度应≥99%，结果总结在表6中。由表6可知：A、C两个厂家的产品与文献[18，20]规定的标准要求最接近。B、D、E这3个厂家的产品灵敏度与≥99%指标要求还有一定距离。

表5 试剂盒实际检测完成时间及操作情况

2.6.3 特异性

对5个厂家的孔雀石绿快速检测试剂盒的特异性进行分析，结果如表6所示。由表6可知：A、C、D这3个厂家的试剂盒的特异性大于90%，其中A、C这2个厂家的试剂盒的特异性均为100%，满足文献[18,20]中规定的特异性应≥85%的要求，B厂家的特异性与规定的标准要求接近，差1%。

2.6.4 假阴性率与假阳性率

根据文献[18,20]中的规定，孔雀石绿快速检测试剂盒的假阴性率应≤1%，假阳性率应≤15%。从本次评价的结果(表6)上可知，仅A、C、D这3个厂家的试剂盒满足假阳性率指标的要求，C厂家的假阴性率指标与标准要求接近(差1%)，B、E厂家均不符合要求。

表6 5个厂家快检产品性能指标

2.6.5 与参比方法一致性分析

参照文献[18，20]中的方法，用卡方(χ2)检验分析试剂盒快速检测方法与参比方法是否存在统计学差异，结果见表7。由表7可知：C厂家试剂盒的χ2<3.84，表明该试剂盒的检测结果与参比方法实际状态的阳性确证比率在95%的置信区间内没有显著差异；A、B、D、E厂家的χ2≥3.84，表明该试剂盒的检测结果与参比方法实际状态的阳性确证比率在95%的置信区间内有显著性差异；C厂家试剂盒的检测结果的相对准确度最高，接近100%，其次为A，这两个产品的方法与现有方法的一致性要求最接近。

表7 5个厂家试剂盒测试结果

3 结论与建议

本次研究不仅从产品的性能指标(灵敏度、特异性、假阴性率和假阳性率)对产品做出评价，同时也考察了各产品的样品前处理操作难易程度、检测时间与检测成本、辅助仪器设备、结果判定、适用性等。通过本次评价可以看到，在用的孔雀石绿快检产品的特异性总体较好，但质量参差不齐，有3个厂家假阳性率≤15%。建议必须建立出厂评价验收制度，在市售水产品中孔雀石绿的快速检测产品采购前，对产品做出综合有效评价，确保产品质量。

对快速检测产品做出公平公正的评价应综合性评判，不仅要参考国家评价标准，还需要综合评价其他因素。根据实际检验结果，在用的这5个厂家的产品在所有4项指标上没有一家达到国家标准的要求，但不代表所有厂家的产品质量都不合要求。在所有200个样品中，C厂家产品仅1个样品检测错误。A、C、D厂家产品，其特异性与假阳性率达到国家食品药品监督管理总局规定的指标，灵敏度与假阴性率距离快检标准指标差距较小。

浓度水平设置也是影响评价结果水平的关键要素。本次孔雀石绿快速检测方法为胶体金免疫层析法，该方法灵敏度高、特异性强，但该方法以定性检测为主，不能准确定量，检测结果容易对一定范围的浓度变化不敏感，浓度接近检出限水平的样品极有可能检测出假阴性。因此，设置不同水平样品(尤其是介于空白和检出限水平以及检出限附近水平的样品)评价同—快检产品会造成性能指标的差异，特别是不同机构出具的评价结果报告也会彼此矛盾，易造成市场混乱。

评价实验工作环境不能达到暗室环境的要求，且快速检测试剂盒实际使用过程中不能达到无光环境的要求，考虑到实际应用情况，本次评价实验仅使用添加隐色孔雀石绿的样品为盲样，以消除孔雀石绿在自然环境下的降解干扰，避免因孔雀石绿降解而造成的浓度水平差异而导致评价结果的偏差。

本次孔雀石绿的快速检测法前处理过程需经过提取、氮吹浓缩等步骤，这些操作相对其他快速检测法仍相对繁琐，如若在实验室进行，则需要很多大型仪器，占地空间较大。鉴于此，有些厂家提供了可以同时进行提取、浓缩、离心等步骤的可移动式全自动提取仪，但该仪器操作通量小，一次只能完成几个样品的检测，在实际现场应用时还有很多限制，有些厂家在完成这些前处理步骤时仍需借助实验室仪器，给实际推广应用带来困难。

快检产品的结果判断与检验人员的经验相关度较大，特别是对弱阳性和弱阴性样品的判断。本次评价时，其中一家公司对一组弱阳性的样品全部判定为阴性，使评价结果总体相差较大。建议国家出台快检人员的定期考核制度，以保证快检结果的准确性。判读方式需进一步标准统一化。该方法最后的判读时通过比较T线(检测线)与C线(控制线)的颜色深浅来判定阳性/阴性结果。在评价实验工作中，有些厂家的检测试剂盒的颜色深浅比较仅凭肉眼识别极易造成人为判断误差，对结果判定造成影响，因此亟须建立统一的数字化判读标准。