色氨酸合成酶基因工程菌转化液提取工艺

穆斓慈，徐礼生，罗紫韩，方容

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

L-色氨酸是一种芳香族氨基酸，带有苯环和吲哚基[1-3]，乙醇溶液中稍微溶解，偏碱溶液中性质稳定[4]。L-色氨酸在食物中含量较为丰富[5]，具有治疗癞皮症和舒缓疼痛等作用[6-9]，通过化学法合成时，有周期长、价格昂贵等缺点[10]。L-色氨酸的市场需求越来越大，出现供不应求的现象[11]，通过基因工程菌等微生物合成L-色氨酸，成本低廉[12-13]。色氨酸分离方法有离子交换法[14-16]、结晶法、有机溶剂萃取法等[17]。其中离子交换法操作方便、成本低，离子交换树脂是离子交换法中最常用的吸附剂，分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂[18-20]。采用可见分光光度法[21]等方法来检测L-色氨酸。拟选用717 阳离子树脂对L-色氨酸进行吸附和洗脱，探究实验的最优条件，最后将转化液按照最优条件进行提取，通过蒸发、浓缩和结晶得到产物。

1 试验材料与方法

1.1 仪器与主要试剂

酵母粉、抗生素氨苄青霉素、D-乳糖、鱼粉蛋白胨、吐温-80、5%磷酸吡哆醛溶液(g/L)、层析展开剂、L-色氨酸标准液、0.5%的茚三酮(g/L)、2 mol/L 的氢氧化钠、2 mol/L 的盐酸溶液等。层析展开剂：正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2。GI100T 型高压蒸汽灭菌锅、PHS-3C 型pH 计、WT-ZNO 型洁净工作台、ZHCI-ENG 型恒温振荡培养箱、GL-10MC 立式高速冷冻离心机(上海允延仪器有限公司)、R205B 旋转蒸发仪(上海申胜有限公司)、傅里叶变换红外光谱仪。

1.2 菌种处理

色氨酸合成酶基因工程菌解冻，取2 只装有3 mL Luria-Bertani 液体培养基（LB 培养基）的试管，每管加入200 μL 菌种和7 μL 氨苄青霉素，然后放入摇床培养，设置摇床培养条件为37 ℃、170 r/min、10 h，通过这一步得到第一代活性菌。再按照上述步骤进行第二代、第三代菌种的活化，三代活化结束后取1 mL 甘油和水(1∶1)的混合液放入保种管中，再加入1 mL 菌液。菌种发酵和离心后放入冰箱冷冻室中保藏备用。

1.3 转化液的制备

1 mL 表面活性剂（磷酸吡哆醛）、100 μL 的吐温-80，后加入1 g 的L-丝氨酸和1.1 g 的吲哚，搅拌均匀后调节pH 值为8.0，加入色氨酸合成酶基因工程菌0.01 g，定容到100 mL，放入摇床（37 ℃、170 r/min、10 h）培养，再放入高速离心机(4 ℃、10 000 r/min、20 min)中离心，离心结束后取上层清液，用取样针吸5 μL 上清液进行点样分析。

1.4 L-色氨酸标准曲线绘制

配制10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%五种体积分数(g/L)的色氨酸标准液，准备五只试管，每只试管中先加入2 mL 0.5%茚三酮，再分别加入上述五种体积分数的色氨酸2 mL，待试管中溶液显蓝紫色后，测其吸光值，并绘制出标准曲线。

1.5 吸附试验

1.5.1 阳离子交换树脂预处理

称取717 树脂50 g，加入纯水反复搅拌，直至洗掉树脂中的悬浮颗粒和杂质后将水倒出，然后用纯水浸泡2 h 后倾出水，加入2 mol/L 的盐酸溶液，浸泡4 h 后倾出，用纯水反复洗至中性，再加入2 mol/L 的氢氧化钠溶液，浸泡4 h 后，用纯水反复洗至中性，最后用盐酸溶液冲洗，使树脂成酸型，再用纯水反复洗至中性，重复三次即可。

1.5.2 阳离子树脂的再生

用纯水反复将用过的717 树脂先洗成中性，用盐酸溶液(2 mol/L)浸泡一段时间，当树脂呈酸型后将水倒出，再用纯水将悬浮颗粒和杂质洗去直至呈中性。

1.5.3 静态吸附试验

称取预处理过的717 树脂1.5 g，加入10 mL 质量浓度为10 g/L 的色氨酸标准液，于室温下浸泡8 h后采样分析，当测得溶液的吸光值不变时的时间为吸附平衡时间，重复做三组。

平衡洗脱率:(洗脱前吸附量-洗脱后吸附量)/洗脱前的吸附量×100式中：C0为树脂吸附前溶液中含有的色氨酸体积分数(g/L)；C 为树脂吸附后溶液中含有的色氨酸体积分 数(g/L)；V 为溶液的体积(L)；W 为预处理后的树脂重量(g)。

1.5.4 静态洗脱试验

将上一步的三组树脂倾出水，用0.5、1、2 mol/L三种氨水各10 mL 分别洗脱这三组树脂，每小时取样分析，当溶液的吸光值不变时，即为洗脱平衡，重复三次，研究不同浓度的氨水对静态洗脱的影响，以及探索氨水体积的差别对洗脱的成效有何作用，确定氨水的最优体积和体积分数。

1.5.5 动态吸附试验

称取717 树脂15 g 放入离子交换柱内，将柱内树脂间的空气尽量排出，比较0.5、1、2 mL/min 三种速度对树脂动态吸附有何作用，每组操作重复三次，确定出动态吸附的最优滴入速度。

1.5.6 动态洗脱试验

用0.5、1、2 mL/min 三种速度的体积分数为2 mol/L的氨水对上一步用1 mL/min 速度吸附平衡的树脂进行动态洗脱，探究洗脱时的最佳氨水滴入速度，每种速度重复三次。

1.5.7 转化液的提取结晶

通过上述实验数据得出实验的最优条件，再按照优化后的条件处理转化液，然后收集流出液经旋转蒸发仪浓缩，待其浓缩至25 mL 后加入2.5 mL 无水乙醇，在4 ℃冰箱中静置24 h，后放入干燥箱中烘干，得到结晶固体。

1.5.8 SPSS 数据分析

实验结果使用SPSS 11.5 进行数据分析，数据均以（x±s）表示，各组之间用t 检验分析。

2 试验结果与讨论

2.1 L-色氨酸标准曲线绘制

配制10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%五种质量分数，分别取一只试管中放入1 mL 一种体积分数的标准液和1 mL 0.5%的茚三酮溶液，共五只试管，待溶液显蓝紫色后，将吸收波长调为570 nm，测得数据绘制成标准曲线，色氨酸的标准曲线方程为y=3.358 1x+0.135 9，R2=0.999 1。

2.2 单因素对717 树脂吸附和洗脱的影响

2.2.1 不同时间、pH 值和标准液浓度对树脂静态吸附率的影响

717 树脂（1.5 g）对10 g/L 色氨酸标准液的吸附率（8 h），得出静态吸附曲线如图1(A)，从图1(A)中看出6 h 左右时717 树脂的吸附平衡，717 树脂对色氨酸吸附最佳时间为6 h。称取5 组预处理过的717 树脂(每组1.5 g)，分别在10 mL pH 值为5、6、7、8、9 标准液(10 g/L)吸附6 h，平衡吸附率如图1(B),发现pH值对树脂吸附L-色氨酸的量影响小。称取预处理过的树脂1.5 g 分别放入浓度为17.5、15、12.5、10、7.5、5 g/L 的标准液中吸附，6 h 后测定吸附率如图1(C)。浓度为15 g/L 的吸附量最好，但浓度超过10 g/L 之后，树脂对其吸附量增长幅度比较小。

图1 717 树脂静态吸附曲线Fig.1 Static adsorption curve of 717 resin

2.2.2 氨水对树脂静态洗脱率的影响

准备三只锥形瓶，每个瓶中放入预先处理好的树脂1.5 g，用10 mL 体积分数为0.5、1、2 mol/L 的氨水洗脱，结果如图2（A）所示。3 h 左右时色氨酸的洗脱已经达到洗脱平衡，所以选择3 h 作为717 树脂的最佳洗脱时间，且洗脱性能最优的氨水体积分数为2 mol/L，洗脱率达94%。用10、15、20、30、40 mL 的氨水(2 mol/L)洗脱5 组吸附平衡的树脂(每组1.5 g)3 h，取样分析，结果如图2（B），随着氨水体积增加，色氨酸洗脱率增高，当体积为40 mL 的时候为97.6%，氨水体积选用20、30、40 mL 时洗脱率无显著差异。

图2 不同氨水浓度(A)和氨水体积差异（B）对洗脱速率的影响Fig.2 Comparison of elutionwith different ammonia concentration (A) and volume (B)

2.2.3 标准液滴入速度对动态吸附试验的影响

采用三种流速0.5、1、2 mL/min 动态吸附体积分数为10 g/L 的色氨酸，每50 mL 取样分析一次，结果如图3（A）所示，流出液体积分数最高时，标准液滴入速度为2 mL/min，而流出液体积分数最低时，标准液滴入速度为0.5 mL/min。高流速下树脂与色氨酸标准液不能接触完全，而在低流速下则致使阻力增加溶液不易流出，流速为1 mL/min 为最佳吸附速度。

2.2.4 氨水滴入速度对树脂动态洗脱的影响

准备三组717 树脂各15 g 填入三个交换柱中，上柱吸附的速度为1 mL/min，体积分数为2 mol/L 氨水分别用0.5、1、2 mL/min 三种速度滴入这三组树脂，试验结果如图3(B)所示，比较这三种洗脱速度可知，0.5 mL/min 的滴入速度下呈现的峰值最高，因而洗脱最有成效，流出液体积分数为8.64 g/L，与色氨酸标准液浓度差距很小，0.5 mL/min 为最佳洗脱流速。

图3 动态吸附时标准液不同滴入速度(A)和氨水不同滴入速度（B）流出液体积分数比较Fig.3 Comparison of the concentration of effluent at different dripping rates(A) of standard liquid and different dripping rates (B) of ammonia during dynamic adsorption

2.3 转化液动态试验结果分析

采用层析法对得到的转化液和色氨酸标准液进行点样分析，将实验得到的100 mL 转化液稀释3 倍，再按上述实验中得出的最优条件处理，即吸附时的最优滴入速度为1 mL/min 和洗脱时的最优滴入速度为0.5 mL/min，洗脱时收集所有流出溶液。然后使其在旋转蒸发仪(60 ℃)中浓缩和结晶，晶体烘干得到棕黄色粉末，称量结果为0.726 3 g，L-色氨酸回收率为72.63%。

3 结论

通过上述所有试验研究不同因素对树脂吸附和洗脱的影响，研究结果表明：1 mL/min 为吸附时最优动态滴入速率,氨水体积分数为2 mol/L，氨水用量为20 mL，0.5 mL/min 为洗脱时最优动态滴入速率，动态实验下717 树脂对L-色氨酸吸附和洗脱，L-色氨酸回收率为72.63%。