广东省某猪场链球菌的分离鉴定及耐药性分析

韩 宁，李 杰，陈佳文，李桂花，黎 智，李梓楠，熊文广，曾振灵

(1.华南农业大学 兽医学院 广东省兽药研制与安全评价重点实验室/国家兽医微生物耐药性风险评估实验室，广东 广州 510642)

链球菌是一种重要的人畜共患病病原菌，常定植于上呼吸道中，能通过呼吸道、受伤的皮肤及黏膜感染人类和畜禽，在临床上引起脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症等疾病，严重时可导致死亡。该病不仅给养殖业带来巨大危害，也给从业人员带来了威胁，严重危害公共卫生安全[1-4]。

1998年，江苏省部分地区猪群暴发猪链球菌病[5]；2005年，四川省就已报道过人感染猪链球菌，并引起暴发性流行[6]。在1999―2019年，广西壮族自治区有46例人感染猪链球菌的病例，93.48%的患者发病前有与病猪、死猪的接触史或者从事生猪贩卖、加工等工作[7]。2019年10月，四川省某猪场保育猪突然发病，通过对病死猪进行细菌的分离鉴定，发现病原为猪链球菌2型，该菌株具有较高的致病性，而且耐药谱广泛，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、酰胺醇类、林可胺类和磺胺类等抗菌药物具有较高的耐药性[8]。

目前，治疗猪链球菌病的一线药物主要为青霉素类、四环素类、林可酰胺类等抗生素。大环内酯类抗生素曾作为临床治疗猪链球菌感染的主要抗生素之一被广泛应用于兽医临床、畜禽养殖等领域，其滥用导致猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药率快速升高。AARESTRUP等[9]对丹麦不同年份分离的猪链球菌进行耐药性检测发现，1967―1981年的分离株中血清型2型猪链球菌对大环内酯类抗生素均敏感，而1992―1997年分离的菌株中对大环内酯类抗生素耐药率高达20.4%。孙晓东[10]对我国沈阳地区15个猪场进行猪链球菌的调查发现，分离株对四环素类、大环内酯类、β-内酰胺类和林可霉素类抗菌药物的耐药率较高，呈现多重耐药表型。目前，链球菌对大环内酯类、林可酰胺类抗生素耐药性严重，且在链球菌中大环内酯类抗生素、林可酰胺类抗生素和链阳菌素B的耐药性往往同时产生，称为MLSB型耐药表型，通常由erm(B)基因介导[11]。四环素类药物因具有抗菌谱广，价格低廉且毒性较低等优点广泛应用于畜禽养殖和人医临床中[12]，然而其广泛且不合理使用也导致了细菌对其敏感性的降低，同时相关耐药基因的水平传播也是四环素类抗生素耐药的主要原因[13]。据报道，中国、西班牙、日本等四环素耐药率超过90%，2008―2010年中国猪源链球菌四环素耐药率达99.1%[14]。因此，本试验通过对猪源链球菌进行分离鉴定，并对分离菌株进行耐药性分析及耐药基因进行检测，了解链球菌在猪场中的分布情况、耐药性特征以及耐药基因的流行情况，以期为临床链球菌病的防治及合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株及样本金黄色葡萄球菌ATCC 29213由本实验室所保存；150份猪鼻拭子采集于广州市从化区某猪场。

1.2 主要试剂胰蛋白大豆琼脂(TSA)、胰蛋白大豆肉汤(TSB)、MH琼脂、MH肉汤等均购自广东环凯微生物科技有限公司；无菌脱纤维绵羊血购自广州蕊特生物科技有限公司；革兰染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；2×PCR mix 购自东盛生物科技公司；青霉素(98.00%)、氟苯尼考(98.00%)、四环素(95.00%)、红霉素(92.00%)、万古霉素(90.00%)、磺胺甲噁唑(99.00%)、甲氧苄啶(98.00%)等均购自广州翔博生物科技有限公司；克林霉素(80.00%)、利奈唑胺(95.00%)购于北京康倍斯科技有限公司；氨苄西林(96.00%)、头孢噻呋(98.00%)、美罗培南(98.00%)购于大连美伦生物技术有限公司。

1.3 细菌分离加入适量含5%胎牛血清的TSB肉汤于猪鼻拭子样品中，37℃、180 r/min过夜培养；将过夜培养的菌液划线于TSA(含5%脱纤维绵羊血)固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养18 h；挑取呈灰白色或半透明，针尖大小，周围形成溶血环的疑似菌落转接于TSA(含5%脱纤维绵羊血)平皿进行纯化；挑取纯化后的单菌落涂布于TSA(含5%胎牛血清)平皿进行增菌，刮取菌苔于30%甘油肉汤中，-20℃保存。

1.4 革兰染色和镜检挑取纯化后的单菌落于少量无菌水中涂在载玻片上，待菌液晾干后利用革兰染液进行染色，并在显微镜下观察细菌形态。

1.5 PCR鉴定采用水煮法提取分离菌株DNA，根据参考文献[15]设计合成特异性引物EF-Tu(表1)进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR扩增产物于1.5%琼脂糖电泳检测，用凝胶成像分析系统观察结果。将PCR阳性产物送至广州擎科生物技术有限公司进行序列测定，将测序结果上传至NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对。

表1 试验中所用部分引物

1.6 药物敏感性试验采用琼脂扩散法对分离菌株进行13种抗菌药物(青霉素、头孢噻呋、氨苄西林、阿莫西林、红霉素、克林霉素、四环素、美罗培南、利奈唑胺、万古霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、复方新诺明)最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定，根据CLSI和EUCAST标准进行试验及结果判读，以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌。

1.7 耐药基因检测采用PCR方法检测四环素相关耐药基因tet(O)、tet(M)、tet(L)、tet(K)，噁唑烷酮类耐药基因optrA、cfr、poxtA，大环内酯类耐药基因erm(A)、erm(B)、erm(C)、mef(A)，磺胺类耐药基因Sul1、Sul2、Sul3，氨基糖苷类耐药基因ApH3′，酰胺醇类抗生素耐药基因cat1、cat2，β-内酰胺类耐药基因pbp2b，根据参考文献[16-19]合成设计相关耐药基因。PCR反应体系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性30 s；t退火30 s；72℃延伸，共30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

2 结果

2.1 链球菌分离及鉴定结果将疑似菌落染色后在油镜下观察细菌形态，为革兰阳性，呈圆形，单个或链状分布(图1)；利用特异性引物对疑似菌株进行PCR扩增，有40个样品检测出约197 bp的条带，与目的条带大小相符，测序后鉴定为链球菌，检出率为26.67%；其中4株检测为猪链球菌，进行血清型分型未检测出2型猪链球菌(图2)。

图1 链球菌革兰染色结果(×100)

图2 部分分离菌株EF-Tu基因鉴定结果

2.2 药物敏感性试验结果采用琼脂扩散法对40株链球菌进行13种临床常用抗菌药物敏感性试验。结果显示，40株链球菌对克林霉素、四环素、红霉素和氟苯尼考的耐药率较高，分别为92.50%，90.00%，85.00%，80.00%；其次是氨苄西林、复方新诺明、青霉素、恩诺沙星，耐药率分别为77.50%，72.50%，70.00%，55.00%；且呈现多重耐药表型，多重耐药率为87.50%，其中以对8种抗菌药物耐药菌株为主(32.50%)，同时发现2株链球菌对12种抗菌药物(红霉素、克林霉素、四环素、青霉素、头孢噻呋、氨苄西林、利奈唑胺、万古霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、复方新诺明、阿莫西林)耐药；对阿莫西林、头孢噻呋、美罗培南等药物仍较为敏感，进行链球菌的防治时可考虑采用阿莫西林和头孢噻呋(图3)。

图3 链球菌药敏试验结果

2.3 耐药基因检测结果耐药基因检测结果显示，分离菌株中四环素类耐药基因tet(M)的检出率最高(60.00%)，其次为tet(O)(35.00%)，仅1株链球菌携带tet(K)，耐药基因tet(L)未检出；大环内酯类耐药基因中erm(B)检出率最高(50.00%)，erm(A)、erm(C)、mef(A)均未检出；磺胺类耐药基因中Sul1、Sul2、Sul3的检出率分别为62.50%，27.50%，22.50%；噁唑烷酮类耐药基因optrA、cfr、poxtA中，optrA检出率为12.50%，cfr和poxtA均未检出；氯霉素类耐药基因cat1、cat2均未检出；氨基糖苷类耐药基因ApH3′检出率为72.50%；β-内酰胺类耐药基因pbp2b未检出(图4)。

图4 四环素类抗生素耐药基因检测结果

3 讨论

目前，链球菌属内有超过30种链球菌，其中10余种为常见的人畜共患病原菌，于自然界中广泛存在。链球菌可致人及畜禽各种化脓性炎症、肺炎、乳房炎等，在我国被列为二类动物疫病。链球菌在我国各地区猪场普遍存在，各种年龄段的猪均可感染，该病发病率和病死率均较高，对我国畜禽养殖业带来了巨大的威胁。

本试验对采集的150份猪鼻腔拭子进行链球菌的分离鉴定，共分离链球菌40株，分离率为26.67%(40/150)。夏冰芝[20]对2019―2020年酒泉市的猪肉样品进行链球菌的分离鉴定，共分离链球菌84株，分离率为28.00%(84/300)。谭美芳等[21]对江西省规模化猪场进行采样，进行猪链球菌的流行病学调查，共从314份猪鼻腔拭子中分离112株猪链球菌，分离率为35.67%。赵霞玲等[22]通过采集西藏地区藏猪不同类型的样品进行猪链球菌的感染情况的调查，发现鼻腔拭子样品中猪链球菌的分离率最高，其次为脑、肺。本试验从鼻拭子中进行链球菌的分离率为26.67%，处于较高水平，表明该猪场链球菌的感染较为严重，同时也证明猪鼻腔拭子可作为检测链球菌的重要样品来源。

通过二倍琼脂扩散法检测13种临床常用抗菌药物对40株链球菌的MIC，发现多数为多重耐药，对红霉素、克林霉素、四环素和氟苯尼考表现出较高耐药率(≥80%)，其中对四环素及克林霉素的耐药率高达90%以上，结果与陶政[23]对江西地区的猪链球菌对四环素耐药率达96.78%及红霉素达80.64%一致。TIAN等[17]对中国11个省735份奶牛乳样进行检测，分离所得64株链球菌均为多重耐药，对四环素的耐药率高达98.44%。张玲梅[24]对分离自重庆、贵州养殖场和屠宰场的58株链球菌进行耐药性检测，发现对四环素、克林霉素的耐药率超过80%，且多重耐药率高达90%。四环素和红霉素等药物仍是临床常用药物，广泛应用于人医临床及畜牧业中，然而从药敏结果来看，链球菌对四环素、红霉素等药物的耐药趋势明显。

本试验共测定四环素类、大环内酯类、磺胺类、噁唑烷酮类、氯霉素类、氨基糖苷类和β-内酰胺类等7大类耐药基因，其中氨基糖苷类耐药基因ApH3′检出率最高(72.50%)，其次为磺胺类耐药基因Sul1(62.50%)，四环素类耐药基因tet(M)(60.00%)，大环内酯类耐药基因erm(B)(50.00%)。药物敏感性检测结果显示复方新诺明、克林霉素、四环素和红霉素的耐药率分别达到72.50%，92.50%，90.00%和85.00%，其耐药基因的高检出率与高耐药率表现一致。细菌对四环素类抗生素的耐药性主要由tet(M)、tet(O)、tet(L)、tet(K)等基因决定，在革兰阳性菌中主要为tet(M)和tet(N)介导的核糖体保护作用，tet(K)和tet(L)在革兰阳性菌中的分布存在差异，tet(K)常见于金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中，tet(L)更多传播于链球菌中[25]。在本研究中四环素耐药基因显示为tet(M)、tet(O)检出率高，其中tet(K)未检出与之前的研究结果相符。

综上所述，本研究通过对150份鼻拭子进行链球菌的分离鉴定，药物敏感性试验及耐药基因的检测，发现分离的40株链球菌对克林霉素、四环素、红霉素、氟苯尼考等耐药率较高，且多重耐药现象严重；对阿莫西林、头孢噻呋等药物仍较为敏感，临床进行链球菌的防治可考虑使用阿莫西林及头孢噻呋等药物。