免疫印迹法检测ENA抗体在诊断自身免疫性疾病中的应用价值

王 勇，童华诚，王 蓓，于 慧，吴萍萍

（东南大学医学院附属南京同仁医院医学检验科，江苏 南京 211102）

自身免疫性疾病是指机体对自身抗体发生免疫反应，引起自身组织损害的一类疾病，包括混合性结缔组织病（MCTD）、多发性肌炎/ 皮肌炎（PM/DM）、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、类风湿关节炎（RA）等[1]。此病患者的机体可产生病理性自身免疫反应，破坏和损伤自身的组织和细胞成分，引起组织损害和多器官功能障碍。此病通常累及血液、关节、肌肉、骨骼及关节周围的软组织等全身各个系统。临床研究表明，抗干燥综合征抗原B 抗体、抗双链DNA 抗体、抗核糖体P 蛋白抗体等常见的抗体在鉴别诊断各类自身免疫性疾病中有较高的敏感性和特异性，是诊断自身免疫性疾病的关键指标[2]。抗可溶性抗原（ENA）抗体是针对核内可提取性核抗原的一种自身抗体，主要包括抗核糖核蛋白抗体（RNP）和抗酸性核蛋白（Sm）抗体等。采用间接免疫荧光法、胶体金法、免疫斑点法、免疫印迹法（IBT）等检测ENA 抗体，有助于临床上诊断及鉴别诊断自身免疫性疾病[3]。本文主要是探讨采用IBT 检测ENA 抗体在诊断自身免疫性疾病中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020 年1 月至2021 年1 月我院收治的自身免疫性疾病患者72 例作为研究对象。其纳入标准是：病情符合自身免疫性疾病的诊断标准[4-5]；病历资料完整、真实；对诊治的依从性良好；沟通能力正常；知晓研究内容，并签署了知情同意书。其排除标准是：免疫功能严重低下；处于妊娠期或哺乳期；合并有精神疾病；生命体征不稳定；临床资料不全；机体状况较差，对检查及相关治疗的依从性或耐受性不佳。随机将其分为观察组和对照组，每组各有患者36 例。在观察组患者中，有男18 例，女18 例；其年龄为28 ～60 岁，平均年龄为（48.5±6.1）岁。在对照组患者中，有男20 例，女16 例；其年龄为29 ～60 岁，平均年龄为（48.9±6.2）岁。两组患者的一般资料相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究已通过我院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫斑点法 采用酶联免疫斑点法对对照组患者进行ENA 抗体检测，方法是：采集患者的外周静脉血3 mL（不在标本中加入抗凝血），经离心处理（转速为3000 r/min）后分离出血清。采用酶联免疫斑点法测定血清中ENA 抗体的表达情况，ENA 抗体主要有抗SS-A 抗体、抗SS-B 抗体、抗U1-nRNP抗体、抗Sm 抗体、抗Scl-70 抗体、抗Jo-1 抗体等。检测所用的试剂盒购自欧蒙医学实验诊断有限公司，严格依据试剂盒的说明书完成相关操作。

1.2.2 IBT 采用IBT 对观察组患者进行ENA 抗体检测，方法是：采集患者的外周静脉血3 mL（不在标本中加入抗凝血），经离心处理（转速为3000 r/min）后分离出血清。将检测膜条放入温育槽中，并在每槽中加入1.5 mL 的样本缓冲液，摇摆摇床温育5 min。在装有膜条的测定槽中加入1 mL 的洗涤剂和10 μL的血清，置于37℃的温水中洗涤30 min。取出后连续洗涤4 次，每间隔1 min 需通过滤纸进行吸干处理。之后行第一步温育处理：吸去槽内液体，在温育槽中分别加入1.5 mL 已稀释（1:101）的血清，摇摆摇床温育30 min。清洗：吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5 mL工作浓度的清洗缓冲液清洗膜条3 次，每次5 min。第二步温育：吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 mL 的酶结合物，摇摆摇床温育30 min。清洗：吸去槽内液体，在摇摆摇床上用1.5 mL 工作浓度的清洗缓冲液清洗膜条3 次，每次5 min。第三步温育：吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5 mL 的底物液，摇摆摇床温育10 min。终止：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗3 次，每次1.5 mL。采用台式扫描仪扫描，并采用EUROLineScan 软件评价结果。检测所用的试剂盒为欧蒙医学实验诊断有限公司生产的抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒，严格依据试剂盒的说明书完成相关操作。

1.3 观察指标

观察采用IBT 对观察组患者进行ENA 抗体检测的结果。统计并比较两组患者中不同类型自身免疫性疾 病（PM/DM、RA、SLE、MCTD、SS） 患 者ENA抗体的阳性检出率。记录观察组患者室内质控抗体的检出率。

1.4 统计学方法

经Microsoft Excel 建立数据库，采用SPSS 22.0软件处理本研究中的数据，计数资料用% 表示，用χ² 检验，计量资料用均数± 标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用IBT 对观察组患者进行ENA 抗体检测的结果

采用IBT 对观察组患者进行ENA 抗体检测出的ENA 抗体主要为抗SS-A 抗体、抗SS-B 抗体、抗U1-nRNP 抗 体、抗Sm 抗 体、抗Scl-70 抗 体、抗Jo-1 抗体等。在本组36 例患者中，有29 例（占80.56%）患者检出至少2 种ENA 抗体。

2.2 两组患者中不同类型自身免疫性疾病患者ENA 抗体的阳性检出率

本研究中两组患者所患的自身免疫性疾病主要有MCTD、PM/DM、SLE、SS、RA。与对照组患者相比，观察组患者中的PM/DM、RA、SLE、MCTD、SS 患者其ENA 抗体的阳性检出率均显著高于对照组患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 两组患者中不同类型自身免疫性疾病患者ENA 抗体的阳性检出率[例（%）]

2.3 观察组患者室内质控抗体的检出率

采用IBT 对观察组患者进行ENA 抗体检测时，其抗Jo-1、Scl-70 室内质控抗体的检出率均为100.00%，抗SS-A 室内质控抗体的检出率为97.22%，抗U1-nRNP 室内质控抗体的检出率为97.22%，抗SS-B、Sm 室内质控抗体的检出率均为94.44%。提示采用IBT 进行ENA 抗体检测可靠、准确。

3 讨论

自身免疫性疾病是由自身免疫应答反应异常所导致的一类疾病。此病通常会侵犯人体的多个器官和系统。通过分析PM/DM、RA、SLE、MCTD、SS 等自身免疫性疾病的共同点，发现在此类患者的血液中均能检测出多种高滴度的器官特异性和非特异性自身抗体，这些抗体均存在免疫学改变，其在自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断及活动性监测中有较高的应用价值[6]。ENA 抗体是一类能够在血液中检测到的抗核抗体，其核内成分复杂，包括核糖核酸、脱氧核糖核酸等。IBT 可从分子水平和抗原不同表位，有效识别出抗体作用的抗原蛋白多肽分子量的不同，是一种全新的检测技术[7]。相较于酶联免疫斑点法，IBT 能够实现对多种抗体的识别，具有更高的敏感度和特异性，能有效鉴别诊断出易混淆的自身免疫性疾病，为后续的相关治疗提供实验室依据[8]。ENA 抗原主要存在于细胞核与细胞质中，其中Sm 与RNP 通常是由携带有尿嘧啶核苷的U 族RNA 与抗核蛋白所构成的抗原，而SS-A 和SS-B 多是由RNA 与其他蛋白结合产生的物质[9]。流免疫电泳法（CIE）也是临床上检测ENA 抗体的一种方法。研究指出，采用CIE 检测ENA 抗体时，存在纯化困难的问题，会影响诊断的敏感性和特异性，且仅仅能够检测出4 种ENA 抗体。而采用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行ENA 抗体检测时，能通过分子筛的功能使ENA 中的各种抗原成分在分离之后转印在硝酸纤维素膜上，然后再通过酶联免疫吸附法显示出相应抗体反应的显色带，使ENA 对自身免疫性多肽抗体的表位进行有效划分，进而可使诊断的敏感性和特异性得到显著提升[10-11]。不同自身免疫性疾病患者的体内存在多种ENA 抗体，因此需采用合适的手段对其实施ENA 抗体检测[12-13]。

本研究的结果证实，采用IBT 检测ENA 抗体对诊断自身免疫性疾病具有较高的应用价值。本方法值得在临床上推广应用。