20个玉米自交系SSR指纹图谱的构建

连灵燕，赵 慧，王国英，王建华，孙世贤

（1.长治市潞州区农业农村局，山西 长治 046000；2.中国农业大学 农学与生物技术学院种子科学系，北京 100193；3.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；4.全国农业技术推广服务中心，北京 100125）

DNA指纹图谱是根据每个品种的DNA组成，为其建立的可见的条码式谱带图谱。它提供的证据是品种的基因型，是稳定的DNA带谱，不受栽培条件影响，并可通过计算机进行系统管理。DNA指纹图谱技术可对植物基因做出明确的鉴定，特别是对那些没有准确系谱记载的育种材料进行遗传分类，弥补系谱记载的缺失；育种人员可以采用这项技术鉴定自交系的遗传特征，保护这些自交系的品种权免受侵犯。因此，研究玉米自交系的指纹图谱具有重要意义。

本研究利用SSR分子标记技术构建20个玉米自交系的指纹图谱，以期找出其特征谱带，以便进一步利用并发挥其优势。

1 材料和方法

1.1 供试材料

本研究所用的材料包括20份玉米自交系，其中昌7-2、P138、478、HC、Mo17、Sh15、郑58、B73、丹598、9058为育种中常用的优良自交系，HCL2、HCL4、HCL5、P1、紫58、P2、J53、L50、Y1382、Y1281为中国农业大学农学与生物技术学院种子科学系近年选育的优良自交系。

表1 20个玉米自交系的编号及名称Tab.1 The number and name of 20 maize inbred lines

1.2 SSR分析

1.2.1 基因组DNA提取

采用改进的CTAB法提取叶片总DNA，用紫外可见分光光度计检测DNA的浓度，将DNA样品稀释至10 ng/μL备用。

1.2.2 PCR扩增

PCR扩增所需SSR引物由上海生工合成，溶解后置于-80℃贮存备用。

反应体系：每20μL体积中含1×EasyTaq Buffer，0.4 mmol/L dNTP Mix，SSR引 物(正 向 引 物 和 反 向 引 物)各0.25μmnol/L，1U EasyTaq DNA聚合酶，20 ng DNA模板，反应液上加盖一滴矿物油，于ABI 9700型PCR扩增仪上进行扩增。反应程序：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共进行35个循环，最后在72℃延伸7 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

在扩增产物中加入1/6体积的Loading Buffer，用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。缓冲液为1×TBE，400V电压电泳2 h，银染显影。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 指纹图谱数字化

读取SSR标记，将SSR带型转换为0、1、2数据，在相同迁移率位置，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“2”，建立数字指纹数据库。

1.3.2 SSR引物的多态性信息量分析

多态性信息量（Polymorphism Information Content，PIC）是指一个标记依靠其可检测的等位基因数和它们的分布频率，从而得到该标记在一个群体中检测的多态性大小值。PIC值按照Anderson等[1]的方法计算，对于标记i的PIC值计算公式为：

式中：Pij——标记i的第j个带型出现的频率，标记i的总带型从1～n。PIC值的大小为0～1，0——无多态性，l——具有非常高的多态性（Anderson et al，1993）。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选及其多态性

本研究依据MaizeGDB（http://www.maizegdb.org/）上提供的资料，初步选择了225对SSR引物。引物的选取原则是在染色体上均匀分布。根据225对SSR引物的扩增结果，最终选取带型清晰、重复性好、多态性高的21对引物作为构建指纹图谱的核心引物，统计结果见表2。21对SSR引物均匀分布于玉米10条染色体上，在20个玉米自交系共检测出105个等位变异，引物等位位点数在3～10个，平均每对引物检测出5.0个等位变异。引物等位位点多态性信息含量PIC变幅为0.460～0.780，平 均0.643。其 中 以 引 物umc2164值 最 高（0.780），引物umc1072值最低（0.460）。从表2还可看出，SSR多态性信息含量与等位变异数不尽一致。

表2 SSR引物序列及其扩增的多态性带数Tab.2 The SSR primer sequence and the number of polymorphic bands amplified

2.2 DNA指纹图谱的构建

根据扩增的带型，选出在大部分材料中都仅扩增出一条谱带，且多态性、重复性好，能区分所有供试材料的引物，用于构建本试验的20个玉米自交系的指纹图谱。其中有umc1038、bnlg2047、umc2323、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707、umc1185等9对引物组合可以将供试材料分开；引物umc1037对材料1有特征谱带；引物umc1185对材料7有特征谱带；引物umc2323对材料12有特征谱带；引物bnlg2047对材料5，13，20有特征谱带；引物umc2164对材料10、16、18有特征谱带；umc1072与phi308707组合区分材料2、3、4；其余材料可由引物bnlg2047、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707与phi116的组合来区分。

赵久然等[3]提出当引物对的等位基因数为N时，理论上该引物可区分的最大自交系的数为N。本研究确定的一套21个核心引物组合可区分的最大自交系数N=1.79×1014，且得到相同指纹图谱的概率P=5.6×10-15。因此，用这套引物来构建20个玉米自交系的指纹图谱是完全可行的。将筛选到的21对引物所扩增的条带出现与否进行记录，将DNA指纹转换成由1和0组成数值，完成指纹图谱的数字化，见表3。

表3 用引物umc2164建立的20个玉米自交系的数字指纹Tab.3 The digital fingerprints of 20 maize inbred lines established with primer umc2164

3 结果与讨论

3.1 玉米自交系SSR指纹图谱的构建与应用

指纹图谱的建立可为自交系材料的保护提供重要依据。此外，指纹图谱的遗传距离、亲缘关系分析同样是对指纹图谱的重要应用，其分析结果可以帮助育种家较为准确地进行种质资源的血缘类群划分以及杂种优势的预测，减少了育种的盲目性。

利用SSR技术建立指纹图谱除了结果可靠、应用广泛的优越性外，也存在一定的局限性。如：改良品种与被改良品种的双亲血缘关系极为相近，难以利用SSR标记将其全部区分。产生这种现象的原因主要是SSR标记与基因连锁不紧密或与SSR标记连锁的基因并不完全表达。所以，在构建玉米DNA指纹图谱时对于差异小的品种如改良品种和转基因品种，应增加引物数量，且最好在每条染色上均匀分布。

3.2 核心引物的选取

在选取核心引物时，多态性信息量是重要的选择条件，但同时还应充分考虑引物对的整体的区分效果,尽可能反映出基因组的差异。多态性信息量高说明其扩增产物的多样性好，能区分较多的供试材料，从而用较少的引物就可以将供试材料分开；对于少数特殊的材料（不易找出特征谱带或不易区分），只有个别PIC值较低的引物，对其有特征性谱带或与其他引物组合才能将其区分开，为了便于区分供试材料也应保留这些引物，如：本实验中引物umc1072、umc1185虽然它的PIC值低于0.5，但由于umc1185对材料7有特征性谱带，umc1072与引物与phi308707组合能区分亲缘关系较近的材料HCL2、HCL4、HCL5。