circ_ACAP2 对胃癌细胞BGC-823 增殖凋亡的影响及作用机制

郑炜智 刘炳辉 杨继洲 盛玲玲 付承林

1.台州市第一人民医院病理科，浙江台州 318020；2.台州市第一人民医院检验科，浙江台州 318020

胃癌在胃肠道恶性肿瘤中较为常见，具有较高发病率，且发病较为隐匿，早期检出率较低，多数患者发现时已为晚期，临床预后较差。采用放化疗对患者治疗，可使临床治疗效果得到改善，但因患者对化疗药物具有一定的耐药性，可增加患者复发、转移风险。环状RNA 结构较为保守、稳定，且特异性较高，表达于患者血液、唾液，可用于肿瘤的诊断、评估。环状RNA–ACAP2（circular RNA–ACAP2，circ_ACAP2）在直肠癌、乳腺癌中高表达，且随着淋巴结的转移逐渐升高。miRNA 为非编码RNA，miR–488–3p 为肿瘤抑制因子，低表达于胃癌患者，其表达升高可抑制胃癌的发展。肌成束蛋白（fascin–1，FSCN1）高表达于肿瘤细胞，且参与肿瘤的预后、分期，可对多种肿瘤细胞的增殖能力进行调控，并参与其淋巴结转移、分化。因此，本研究分析circ_ACAP2通过调控miR–488–3p/FSCN1通路对胃癌的增殖、侵袭、转移作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人胃癌细胞株（BGC–823）、人胃上皮细胞（human gastric epithelial cells，GES–1）购自上海机纯实业有限公司；DMEM 完全培养液购自上海西唐生物科技有限公司；四甲基联苯胺（Tetramethyl benzidine，TMB）溶液购自上海古朵生物科技有限公司；pcDNA、pccirc_ACAP2、anti–miR–NC、anti–miR–488–3p、si–NC、si–circ_ACAP2、miR–NC、miR–488–3p均购自上海GenePharma 公司；细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、B 细胞淋巴瘤–2（B–cell lymphoma–2，Bcl–2）、p21、Bcl–2 相关性蛋白X（Bcl–2–correlation protein X，Bax）、GAPDH 抗体购自上海西唐生物科技有限公司。培养箱（型号：INA–32–8）购自北京乾明基因技术有限公司；电化学发光试剂盒购自上海邦景实业有限公司；全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；四甲基偶氮唑盐（tetramethylazo salt，MTT）试剂盒购自上海西格生物科技有限公司。本研究经台州市第一人民医院伦理委员会批准（批件号：2022–KY001–01）。

1.2 细胞培养

将GES–1、BGC–823 细胞放入含10%胎牛血清的DMEM 培养箱，于37℃ 5%CO、95% N培养箱中培养，培养密度达到80%左右重复传代操作。

1.3 检测方法

1.3.1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌细胞中表达水平检测 提取GES–1、BGC–823 细胞中总RNA，逆转录为cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real–time polymerase chain reaction，qRT–PCR）法鉴定circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 相对表达量，采用Primer5.0 软件设计引物序列，启动PCR 仪，反应体系：0.04ml 上下游引物、0.02mlcDNA 模板、0.01mlSYBGreen，加蒸馏水至0.02ml。反应条件：95℃ 3min、95℃ 15s、60℃40s，72℃ 10min，共进行40 个循环，采用2方法计算出circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 的表达量。

1.3.2 细胞转染 取对数BGC–823 细胞，将其接种于6 孔板，细胞融合至80%时，将si–circ_ACAP2、miR–488–3p、pccirc_ACAP2、anti–miR–488–3p 与阴性对照转染入BGC–823 细胞，对其进行48h 培养。

1.3.3 细胞增殖检测 采用MTT 法检测细胞增殖情况，调整测定细胞浓度，将其接种于96 孔板中，并在孔板中加入0.2ml 细胞悬液，放入37℃、5%CO环境中进行培养，24、48、72h 后加入0.01ml MTT试剂，孵育4h 后采用酶标仪对细胞490nm 处OD 值进行测定，并计算增殖率。试验重复进行5 次，结果取平均值。

1.3.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞术检测细胞凋亡率。取各组细胞，制备细胞悬液，采用Annnexin V–FITC 凋亡试剂盒，37℃避光孵育0.5h，采用流式细胞仪检测细胞凋亡数，试验重复进行5 次，结果取平均值。

1.3.5 CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax检测 采用Western blotting 法检测CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax 表达情况，对所培养的BGC–823 细胞做离心、蛋白提取，之后收集上清，使用BCA 试剂盒检测CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax 蛋白含量，提取等量蛋白质，100℃变性5min，使用凝胶电泳分离，4℃条件下加入一抗孵育过夜，洗涤15min 3 次，加入稀释好的二抗，孵育2h，洗涤15min 3 次，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH 为内参，试验重复进行5 次，结果取平均值。

1.3.6 双萤光素酶报告试验 采用starBase 网站对circ_ACAP2靶基因进行预测，结果显示，circ_ACAP2中含有与miR–488–3p 互补核苷酸序列，包括WT–circ_ACAP2、MUT–circ_ACAP2，将WT–circ_ACAP2、MUT–circ_ACAP2、miR–NC、miR–488–3p 转 入BGC–823 细胞，进行双萤光素酶检测。试验重复进行5 次，结果取平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌细胞中的表达

与GES–1组相比，BGC–823组细胞中circ_ACAP、FSCN1 表达水平均升高，miR–488–3p 表达水平降低，差异均具有统计学意义（＜0.05），见表1。

表1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌细胞中的表达（）

2.2 抑制circ_ACAP2 表达对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响

与si–NC 组相比，si–circ_ACAP2 组circ_ACAP2表达水平降低，差异有统计学意义（＜0.05），表明抑制circ_ACAP2 表达的BGC–823 细胞株构建成功。与si–NC 组相比，si–circ_ACAP2 组CyclinD1、OD值、Bcl–2 降低，p21、Bax 及凋亡率升高，差异均有统计学意义（＜0.05），见表2、图1。

图1 si–NC 组和si–circ_ACAP2 组相关蛋白表达情况

表2 抑制circ_ACAP2 表达对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响（）

2.3 miR–488–3p 过表达对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响

与miR–NC 组相比，miR–488–3p 组miR–488–3p表达水平升高，差异有统计学意义（＜0.05），表明miR–488–3p 过表达的BGC–823 细胞株构建成功。与miR–NC 组相比，miR–488–3p 组CyclinD1、OD值、Bcl–2 降低，p21、Bax 及凋亡率升高，差异均有统计学意义（＜0.05），见表3、图2。

表3 miR–488–3p 过表达对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响（）

图2 miR–NC 组和miR–488–3p 组相关蛋白表达

2.4 circ_ACAP2 靶向调控miR–488–3p 表达

双萤光素酶报告试验显示，与miR–NC 组相比，过表达miR–488–3p 可使WT–circ_ACAP2 萤光素酶活性降低（＜0.05），对MUT–circ_ACAP2 萤光素酶活性影响较小（＞0.05），见表4。

表4 双萤光素酶报告试验（）

2.5 抑制miR–488–3p 表达可逆转抑制circ_ACAP2对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响

与si–NC 组相比，抑制circ_ACAP2 表达可使BGC–823 细胞中miR–488–3p 表达升高，差异有统计学意义（＜0.05）。与si–circ_ACAP2+anti–miR–NC 组相比，si–circ_ACAP2+anti–miR–488–3p 组的CyclinD1、OD 值、Bcl–2 升高，p21、Bax 及凋亡率降低，差异均有统计学意义（＜0.05），见表5、图3。

图3 各组相关蛋白表达情况

表5 抑制miR–488–3p 表达能逆转抑制circ_ACAP2 对BGC–823 细胞增殖、凋亡的影响（）

3 讨论

胃癌在恶性肿瘤中较为常见，可对人类健康、生存造成较大危害，具有较高发病率和病死率。研究显示，原癌基因的激活、抑癌基因的失活可导致胃癌的发生。放化疗可改善早期胃癌患者的治疗效果，但对晚期患者疗效较差，故寻找新的治疗靶点对改善患者治疗效果较为重要。

circRNA 为闭合环状结构，稳定性、保守性较高，存在于真核生物中。多项研究显示，circRNA 在肿瘤中异常表达，circRNA 可参与肿瘤细胞的恶性表型，使肿瘤的发生、发展受到影响。circ_ACAP2 高表达于结直肠癌细胞株，且参与结直肠癌的分期、淋巴结转移，随着淋巴结的转移及分期的增加，肿瘤患者的circ_ACAP2 表达水平逐渐升高，表明circ_ACAP2可使结直肠癌的侵袭、转移加快。研究显示，circ_ACAP2高表达于乳腺癌细胞，可介导miR–29a/b–3p 上调COL5A1 表达，在乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移中具有重要作用。本研究发现，与正常GES–1 细胞相比较，circ_ACAP2 在胃癌细胞BGC–823 中表达升高，且抑制circ_ACAP2 表达，可减缓癌细胞增殖能力，并加快其凋亡，表明circ_ACAP2 可能成为胃癌治疗的重要靶点。

胃癌的发生、发展与多种因素、基因相关，miRNA 为非编码RNA，在胃癌的恶性进展中作用较为重要，可对胃癌的发生、发展进行调控。研究表明，部分miRNA 高表达于胃癌细胞，可促进肿瘤的发展，部分miRNA 低表达于胃癌细胞，可抑制肿瘤的发展。miR–488–3p 在胶质瘤、食管鳞癌、肝癌等恶性肿瘤中具有抑癌作用，miR–488 可使真核翻译起始因子3a 介导的核苷酸剪切修复信号通路激活，使非小细胞肺癌的增殖受到抑制，对化疗的敏感性降低。本研究发现，miR–488–3p 低表达于胃癌细胞，上调miR–488–3p 表达，可使胃癌细胞增殖能力减弱，增加细胞的凋亡能力，降低细胞的侵袭、转移，抑制circ_ACAP2 表达，可促进胃癌细胞中miR–488–3p 表达。相关学者研究显示，miR–488低表达于胃癌细胞，miR–488–3p 可随着胃癌细胞的转移、临床分期的增高逐渐降低。本研究中miR–488–3p 在胃癌细胞株BGC–823 中表达高于正常胃上皮细胞，表明miR–488–3p 在胃癌发展中起抑癌基因作用，circ_ACAP2 可通过靶向结合miR–488–3p，对胃癌细胞的增殖凋亡造成影响。

miR–488–3p 具有较多靶基因，FSCN1 进化较为保守，位于迁移细胞前缘突起，磷酸化后可调节FSCN1 活性，促进细胞表面活性，提高癌细胞增殖、迁移、侵袭能力。本研究结果显示，FSCN1 高表达于肿瘤细胞，且可对肿瘤患者的预后、分期造成影响，并可影响结肠癌、卵巢癌的增殖能力。本研究发现，FSCN1 高表达于胃癌中，circ_ACAP2 可通过与miR–488–3p 结合，调控FSCN1 表达，使胃癌细胞的增殖受到影响，表明miR–488–3p 可通过靶向FSCN1 发挥抑癌作用。

综上所述，circ_ACAP2 在胃癌细胞中表达升高，其表达降低可升高细胞凋亡率，通过调控miR–488–3p/FSCN1 通路实现；抑制circ_ACAP2 靶向调控miR–488–3p/FSCN1 通路，可减缓癌细胞增殖，加快其凋亡，具有较好的治疗效果，有望成为胃癌治疗靶点。