禽腺病毒4型云南株分离鉴定及Hexon基因序列分析

薛晓岩，张振兴，曾 毅，季 佳，代红炀，李素华，宋建领

(1.西南林业大学生命科学学院，昆明 650224；2.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病 重点实验室，昆明 650224；3.水富市两碗镇农业农村和集体经济发展中心，水富 657803；4.会泽黑颈鹤国家级自然保护区管护局，曲靖 654200)

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4,FAdV-4)是近年来中国鸡群暴发的病毒性传染病心包积液-肝炎综合征的主要病原，也是致病性最强的禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)[1]，给中国养禽业造成巨大的经济损失。FAdV-4不仅感染肉鸡、蛋鸡、鸭和鹅，而且在野鸟上也有分离到FAdV-4的报道[2-4]。1987年，在巴基斯坦安卡拉地区的一个肉鸡场首次暴发FAdV-4感染，所以也称为安卡拉病，1989年后该病在世界范围内流行，2013年在中国散在发生[5]，2015年在中国大面积暴发[6-8]，2016年在云南省石林县肉鸡群中分离到云南省首个FAdV-4毒株[9]。按照群特异性抗原不同，FAdV分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群，其中Ⅰ群FAdV又分5个亚群(FAdV-A～FAdV-E)和12个血清型(FAdV1～FAdV8a，FAdV8b～FAdV11)[10]，FAdV-4属于FAdV-C亚群。Hexon蛋白是FAdV病毒颗粒表面最大的衣壳蛋白，含有病毒刺激宿主产生免疫应答的重要抗原决定簇[11]，由2个保守的基底区(P1、P2)和4个高变环(L1～L4)组成，能诱导机体产生中和抗体[12]。由于不同血清型FAdVHexon基因高变区序列的差异较大，因此Hexon蛋白也常用于血清型分类[13-14]。2020—2021年，本研究从云南省发病家禽肝脏组织及野鸟粪便样品中分离出FAdV-4，并对分离株的致病性和Hexon基因序列进行了研究分析，以期探讨云南FAdV-4分离株的毒力特性，为FAdV-4的分子流行病学研究和防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年1月—2021年6月在云南省昆明市、曲靖市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集到疑似感染FAdV-4的家禽肝脏组织样品158份和候鸟迁徙地野鸟新鲜粪便样品310份，将肝脏组织样品剪碎，按1∶10比例加入灭菌生理盐水研磨；粪便样品按1∶5比例加入灭菌生理盐水充分混匀，研磨的混合物和粪便混合液反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液―20 ℃保存备用。

SPF鸡胚购自北京妫川亚申养殖中心；未经FAdV-4免疫的健康白羽肉鸡购自云南云岭广大峪口禽业有限公司。

MiniBEST Viral RNA/DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶和DL2000 DNA Marker等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 PCR扩增

根据GenBank中FAdV-4基因序列(登录号：GU188428.1)，参考文献[6,15]设计FAdV-4检测引物FAdV-4F/R(表1)，预期扩增产物大小为564 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

利用MiniBEST Viral RNA/DNA提取试剂盒分别提取样品滤液中的病毒DNA，以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：TaqDNA聚合酶10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，100 V电泳30 min，拍照保存。

1.3 病毒分离鉴定

参考兰虹等[16]方法，样品滤液通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚0.2 mL，37 ℃恒温培养箱孵育，每12 h观察一次鸡胚，弃去24 h内非特异性死亡鸡胚，无菌收集24～96 h死亡鸡胚尿囊液及胚体。对收集的尿囊液分别提取核酸，采用PCR检测FAdV-4。

1.4 血凝试验

取96孔V型微量板，将微量板横向放置，每行为同种动物1%红细胞悬液，每列为不同检测样品，进行血凝试验，观察红细胞凝集现象。红细胞凝集滴度的判定以反应板倾斜45°，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动，表明红细胞未被病毒凝集；若孔底的红细胞平铺，凝成均匀薄层，倾斜45°后红细胞不流动，表明红细胞被病毒凝集。

1.5 鸡胚半数致死量测定

取FAdV-4阳性样品滤液，经无菌PBS梯度稀释，配制成10-3至10-10病毒液，卵黄囊接种于7日龄SPF鸡胚，每个滴度接种5枚。弃去24 h内死亡鸡胚，记录每天死胚数量，连续观察至96 h，按Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量(ELD50)。

1.6 致病性试验

将30只4周龄未经免疫的健康白羽肉鸡平均分成3组，每组10只，分别为分离毒株YN1905组(试验1组)、分离毒株YN1802组(试验2组)及对照组。试验组分别用106ELD50/mL的病毒液肌内注射1 mL，对照组肌内注射1 mL无菌PBS。每天观察雏鸡临床症状，记录死亡数，连续观察14 d，剖检发病死亡个体，观察大体病变，并采集肝脏组织，制备石蜡组织切片，经HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.7 Hexon基因PCR扩增和测序

根据GenBank中FAdV-4基因序列(登录号：GU188428.1)，参考文献[6,15]，设计用于分段扩增FAdV-4Hexon全基因的3对引物Hexon-1F/R、Hexon-2F/R和Hexon-3F/R(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用MiniBEST Viral RNA/DNA提取试剂盒提取FAdV-4阳性鸡胚尿囊液病毒DNA，以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：TaqDNA 聚合酶10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.8 Hexon序列生物信息学分析

使用SeqMan软件对测序结果进行拼接、处理和编辑，经BLAST进行序列相似性比对，在NCBI中下载相似毒株序列及已发表的FAdV代表毒株序列作为参考序列，参考毒株信息见表2。采用BioEdit进行氨基酸位点变异分析，采用ClustW进行多序列比对，并应用Neighbor-Joining法通过Mega 10.0软件构建Hexon分子系统进化树。

表2 FAdV参考毒株信息Table 2 Reference strain information of FAdV

2 结 果

2.1 病原核酸检测

在采集的158份家禽肝脏组织样品中，FAdV-4核酸阳性19份，阳性率为12.03%；在候鸟迁徙地采集的310份野鸟新鲜粪便样品中，FAdV-4核酸阳性1份(黑颈鹤粪便)，阳性率为0.3%；20份阳性样品PCR扩增产物在564 bp处均检测到预期目的条带(图1)。

M，DL2000 DNA Marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3～21，家禽肝脏组织样品；22，野鸟粪便样品 M，DL2000 DNA Marker;1，Positive control；2，Negative control；3-21，Liver tissue samples from domestic poultry；22，Faecal samples from wild bird图1 样品FAdV-4的PCR检测结果Fig.1 PCR detection results of FAdV-4 in samples

2.2 病毒分离及鉴定

对20份FAdV-4核酸检测阳性对应样品的上清液分别接种SPF鸡胚，盲传3代，其中7份样品的上清液(均来自于发病家禽的肝脏组织样)对3代鸡胚均可致死。与无菌PBS接种的对照组胚体相比，接种样品致死的胚体发育不良、组织器官明显萎缩，胚胎呈现头尾明显卷曲状，且表面覆盖疏松血性渗出物。对鸡胚尿囊液用引物FAdV-4F/R进行PCR扩增，7份可致死鸡胚的样品扩增产物大小约564 bp(图2)，与预期目的条带长度相符。说明从7份样品中分离到FAdV-4，分别命名为：YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108。

M，DL2000 DNA Marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3～9，YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108分离毒株鸡胚尿囊液 M，DL2000 DNA Marker；1，Positive control,2，Negative control,3-9，YN1605,YN2004,YN1802,YN1904,YN2109,YN1905 and YN2108 for chicken embryo allantoic fluid，respectively图2 分离毒株鸡胚尿囊液FAdV-4的PCR检测结果Fig.2 PCR detection results of FAdV-4 of chicken embryo allantoic fluid

2.3 血凝试验

7份FAdV-4样品接种鸡胚的尿囊液对鸡、鸭、兔红细胞均无血凝能力(图3)。

A，鸡红细胞悬液；B，鸭红细胞悬液；C，兔红细胞悬液；1～7，YN1605、YN2004、YN1802、YN1904、YN2109、YN1905和YN2108分离毒株鸡胚尿囊液 A,Chicken erythrocyte suspension;B,Duck erythrocyte suspension;C,Rabbit erythrocyte suspension;1-7,YN1605,YN2004,YN1802,YN1904,YN2109,YN1905 and YN2108 for chicken embryo allantoic fluid，respectively图3 分离毒株血凝抑制检测Fig.3 The blood coagulation inhibition test of the isolated strains

2.4 鸡胚半数致死量测定

由表3可知，Reed-Muench法得到7个分离毒株的ELD50在10-6.17～10-4.32/mL之间。

表3 7个分离毒株的ELD50测定结果Table 3 ELD50 determination results of 7 isolated strains

2.5 病毒致病性试验

用YN1905和YN1802分离毒株感染试验1、2组雏鸡，在感染第1～2天未见明显异常症状；感染第3天2个试验组雏鸡开始出现精神萎靡、嗜睡、羽毛蓬乱、食欲减退等症状；感染第4～6天内可见临床症状加重，表现为头首啄地、绿便腹泻、流涎等，并出现个体死亡；感染第14天2个试验组死亡率高达80%；对照组鸡未出现异常临床表现，无死亡个体。对感染第5天死亡的雏鸡进行剖检可见心包呈水囊状，明显淡黄色澄清的心包积液；肝脏肿大，质脆易碎，颜色苍白，肝叶上分布有出血点或出血斑，伴有坏死灶。肝脏病理组织切片显示，肝血窦淤血，肝细胞变性坏死，炎性细胞显著浸润(图4)。

A，对照组；B，试验1组；C，试验2组 A，Control group;B,Group 1;C,Group 2图4 FAdV-4感染鸡肝脏组织学特征(40×)Fig.4 Histological characteristics of chicken liver with FAdV-4 infection (40×)

2.6 Hexon全基因PCR扩增和测序

分别对7份FAdV-4阳性样本的鸡胚尿囊液提取核酸，对Hexon全基因分3段进行PCR扩增，结果显示，7份样本均在1 110、915和816 bp处出现特异性目的条带，与预期大小相符，部分毒株Hexon基因扩增结果见图5。PCR产物纯化后送测序，所获序列经SeqMan拼接分别获得6株2 814 bp和1株2 811 bp全长Hexon基因序列。

2.7 遗传进化分析

对7株FAdV-4Hexon全基因序列进行核苷酸序列相似性分析，结果显示，7株FAdV-4云南分离株Hexon基因相似性为99.5%～100%；与近几年国内分离的高致病性毒株(SD1511、AH712、HLJFAd15、HB1510等)[12]核苷酸序列相似性在99.7%～100%；与印度分离株(PK-01、PJ-06、B1-7等)核苷酸序列相似性在96.9%以上(图6)。遗传进化分析结果显示，7株云南分离株处于FAdV-C亚群分支，与Ⅰ群的A、B、D和E各亚群FAdV毒株之间亲缘性较低，聚类在不同分支；与国内流行的高致病性株处于同一小分支上，此分支还包括印度株，加拿大株(ON1)、澳大利亚株(KR5)和墨西哥(MX-SHP95)聚类在另一小分支(图7)。

2.8 分离毒株Hexon氨基酸序列相似性及位点分析

7株FAdV-4分离毒株Hexon氨基酸序列间的相似性为99.5%～100%，与参考株氨基酸序列相似性在96.9%～100%，其中与国内高致病性毒株和印度株氨基酸序列相似性较高，分别为99.7%～100%和96.9%～99.7%，与MX-SHP95、ON1和KR5的相似性较低，为98.3%～99.0%(图8)。Hexon氨基酸位点变异主要集中于第160～410位，与ON1、KR5、PJ-06等低致病性毒株相比，变异位点包括T164S、I188R、Q193R、E195Q、N238D、A240T、E243N、M263I、T410A等；与HB1510、HLJFAd15、SD1511等国内高致病性毒株相比具有相同位点，包括164S、188R、193R、195Q、238D、240T、243N、263I等；部分毒株存在S362P、G369A、N663K、G675R等位点变异(表4)。

表4 FAdV-4 Hexon氨基酸序列变异位点Table 4 Variation sites of Hexon amino acid sequences of FAdV-4

3 讨 论

FAdV是家禽和野禽常见的传染病病原，自2015年以来中国暴发了以FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11为主的包涵体肝炎疫情，发病鸡数量逐年增加且致病性增强，给养禽业造成巨大经济损失[16]。目前对FAdV不同血清型之间的鉴定和区分常依赖于PCR法，该方法中如何选择特定靶基因来设计引物是关键。由于FAdV对宿主选择不具有特异性，若选择FAdV全基因组中高度保守基因，则只能鉴定；若选择12个血清型中各独立保守基因，则只能分型。为达到同时进行鉴定和分型的目的，靶基因应具有保守区域和可变区域，且保守区域应围绕可变区域，在保守区域扩增用于FAdV鉴定的同时可变区域用于分型[17]。Hexon蛋白是FAdV病毒粒子的主要结构蛋白，蛋白编码Hexon基因具有保守部区(基座、P1和P2)和可变结构环区域(Loop 1―Loop 4)，保守区域位于病毒体内部，可变环从表面伸出，且可变环含有亚型特异性中和表位。研究表明，来自不同宿主、不同血清型的FAdV可变环区的序列相似性极低，通过对Loop 1区遗传进化分析可确定FAdV的血清型[17-19]，因此对FAdV的鉴定和分型通常以Hexon为靶基因。冯敬敬等[12]、兰虹等[16]、赵玉杰等[20]均以Hexon为靶基因成功鉴定并确定不同血清型的FAdV。本研究以Hexon为靶基因，从云南省不同养殖场疑似FAdV感染的家禽肝脏组织样品和候鸟新鲜粪便中鉴定到20份FAdV-4阳性样品，也是首次在云南越冬的黑颈鹤粪便中检测到FAdV-4核酸，本研究分离获得的7株FAdV-4毒株均来自于发病家禽的肝脏组织样品，黑颈鹤粪便样品中没有分离到FAdV-4毒株，可能与粪便样品中FAdV-4病毒含量太低有关。遗传进化分析显示，7株分离株与C亚群的FAdV-4型分离株亲缘关系较近，与当前FAdV-4国内高致病性流行株及印度株的相似性较高。

Hexon蛋白也是FAdV的主要免疫保护性蛋白，含有特异性抗原决定簇，决定着FAdV-4的致病性[21-24]。研究人员将Hexon特定氨基酸位点特征(如：164S、188R、193Q、195Q、238D、240T、243N、263I、410A等)及病毒具有明确的致病性作为高致病性毒株的的判定标准，且出现任意一项即可判定为高致病毒株[24-25]。FAdV-4 Hexon蛋白氨基酸位点分析显示，云南省分离毒株均具有188R、195Q、238D、240T等的高致病性毒株特征[24-25]。本研究用YN1905和YN1802株感染4周龄白羽肉鸡，可以引起明显的FAdV-4感染导致的临床症状，出现淡黄色澄清的心包积液、肝脏肿大、肝血窦淤血、肝细胞变性坏死和炎性细胞显著浸润等病理变化，死亡率最高达到80%，致病性试验结果验证了分离毒株为高致病性毒株，与国内FAdV-4流行株对雏鸡具有一致的致死性，导致相似的临床症状及病理变化[14]。同时云南部分分离毒株存在362、369、663、675位氨基酸变异，这些位点突变在病毒复制能力、宿主选择等方面的影响仍需要进一步深入研究。

4 结 论

本试验掌握了云南FAdV-4流行情况，首次在云南越冬的黑颈鹤粪便中检测FAdV-4病原核酸阳性。从发病家禽的肝脏组织样中共分离获得7株FAdV-4毒株，具有高致病性特征，属于FAdV-C亚群，与国内流行株和印度株Hexon基因序列相似性极高，亲缘关系较近。分离毒株Hexon蛋白188、193和195位氨基酸处具有与国内高致病性毒株相同特征，部分毒株362、369、663和675位氨基酸处发生突变。