知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤生物学行为的影响

唐剑辉，黄昭明，余盼盼，朱必胜，刘启胜

(咸宁市中心医院，湖北 咸宁 437100)

黑色素瘤是来源于黑色素细胞起病的高度恶性的肿瘤，多发生于皮肤、眼睛，皮肤黑色素瘤与古籍中的“厉痈” “翻花”等十分相似，《内经》中对“厉痈”的描述为“其状赤黑”，《外科正宗》中对“翻花”描述为“乌乌黑黑”[1]。近年来，恶性黑色素瘤的发生率和病死率逐年升高，致死年龄降低[2]。因此，恶性黑色素瘤的早期诊断和治疗极其重要。

黑色素瘤基本病因是黑素细胞发生DNA损伤。中药知母是指植物知母的干燥根茎，性寒、味苦、有滋阴润肺、泄热清火、止咳等功效，知母皂苷AⅢ是知母的最主要活性成分之一，具有改善记忆功能、抗炎、抗氧化、抗病毒、降低血糖、降低血压、抗肿瘤等药理活性[3-4]。miR-494可以调控多种肿瘤疾病的进程。miR-494介导人成纤维细胞生长因子受体2调控骨肉瘤细胞侵袭和迁移[5]。miR-494-3p靶向HTRA1调节瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能[6]。miR-494-3p靶向配子生成素结合蛋白2促进结直肠癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化[7]。本实验主要研究知母皂苷AⅢ调控miR-494对原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 知母皂苷AⅢ购自上海同田生物技术股份有限公司；人黑色素瘤A375细胞株购自美国 ATCC公司；DMEM培养基、胎牛血清，批号：086-150；CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司；二辛可宁酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒来源于上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel胶购自广州锐博生物科技有限公司；Cyclin D1、MMP-2、MMP-9抗体购自美国CST公司；β-actin购自美国Santa Cruz公司；Trizol试剂购自日本Takara公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：体外培养人黑色素瘤A375细胞，分别用0.9%氯化钠溶液(对照组)、4 μmol/L低剂量组、8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组的知母皂苷AⅢ处理A375细胞24 h，作为对照组、4 μmol/L低剂量组、8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组。将miR-NC、miR-494转染至A375细胞，作为miR-NC、miR-494组；将anti-miR-NC、anti-miR-494转染至A375细胞，再用知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)作用，作为anti-miR-NC+16 μmol/L组、anti-miR-494+16 μmol/L组。

1.2.2 细胞增殖情况检测：按每孔0.5×104接种96孔板收集细胞，按照对照组、8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组分组处理后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，继续培育4 h，在酶标仪490 nm处测量细胞吸光度A值，将吸光度A值转换为细胞存活率，得出细胞增殖的结果。

1.2.3 检测细胞Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达情况：每组细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板中，培养1 d后，收集细胞，使用RIPA试剂提取细胞中总蛋白，在蛋白质定量试剂盒(BCA法)定量后，再进行10%SDS-PAGE电泳。电泳后，湿转至PVDF膜，再将封闭与5%脱脂奶粉溶液中1 h。分组放入Cyclin D1(1∶1000)、MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)进行一抗和二抗，然后加显影液进行显影，避光拍照，观察蛋白条带，计算蛋白表达。

1.2.4 检测细胞迁移和侵袭情况：将200 μl细胞(1×105)接种在Transwell上腔室中进行细胞迁移，并将600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基加入下腔室。37 ℃下孵育24 h，将下腔室中的细胞在1%甲醛中固定20 min，并用0.1%结晶紫染色20 min。Olympus显微镜下观察细胞，并取5个随机选择的区域的平均值为迁移细胞数。细胞侵袭，在上腔室中预涂了Matrigel胶，其余步骤与上述步骤相同。

1.2.5 检测细胞miR-494表达水平：Trizol试剂提取各组细胞中总RNA，检测各组中总RNA的纯度和浓度，在A260 nm/A280 nm处于1.8～2.0范围内说明其情况良好，能用于扩增。严格按照说明书操作，将RNA逆转录为cDNA后，进行RT-qPCR扩增。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行35个循环。2-△△Ct法计算相对表达水平。miR-494上游引物：5’-TGGTGATGGGATTTGAAACATACACGGGAAAC-3’，下游引物：5’-AGATAGACGG-TGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’； U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引 物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’[14]。

2 结 果

2.1 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞增殖的影响 与对照组比较，8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组的知母皂苷AⅢ处理细胞后，A值和Cyclin D1蛋白表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而4 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理细胞后，A值和Cyclin D1蛋白表达水平均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1(表1)。

图1 Western blot法检测蛋白表达

表1 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞增殖的影响

2.2 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭的影响 与对照组比较，8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ处理细胞后，细胞迁移数、细胞侵袭数以及迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，说明知母皂苷AⅢ可明显抑制黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭。见图2(表2)。

图2 Western blot法检测蛋白表达

表2 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭的影响

2.3 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞miR-494表达的影响 与对照组比较，8 μmol/L中剂量组、16 μmol/L高剂量组的知母皂苷AⅢ处理细胞后，miR-494相对表达水平显著降低(P<0.05)，说明知母皂苷AⅢ可能通过调控miR-494的表达发挥作用。见表3。

表3 知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞miR-494表达的影响

2.4 过表达miR-494对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-494组细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)，说明过表达miR-494可抑制黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭。见表4(图3)。

表4 过表达miR-494对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图3 Western blot法检测蛋白表达

2.5 抑制miR-494逆转知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与anti-miR-NC+16 μmol/L组比较，anti-miR-494+16 μmol/L组细胞miR-494表达水平显著降低；细胞A值、迁移数量和侵袭数量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)，说明知母皂苷AⅢ可通过miR-494抑制黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭。见表5(图4)。

表5 抑制miR-494逆转知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响

3 讨 论

黑色素瘤恶性程度很高，如果治疗不及时则会病情凶险，《内经》中提到，发现“厉痈”后应该立即治疗，将黑色消除，如果黑色不退反而加重，则无药可治，命不久矣。现代研究表明，长期紫外线照射、摩擦、外伤刺激等导致黑色素细胞DNA发生断裂、转位、突变或异常甲基化等，黑色素细胞发生增殖失控和分化异常，最后发展为恶性肿瘤细胞[1,8-9]。恶性黑色素瘤好发于男性，且男性患者病死率比女性患者高。女性患者的肿瘤好发部位是腿部，男性则为背部和头颈部。

知母是常用中药，有广泛的药理学作用，归肺、胃、肾经，可用于内热消渴、高热烦渴、肠燥便秘等的治疗，知母皂苷是知母的重要组成部分，近些年来，随着对知母皂苷的不断研究，发现知母皂苷AⅢ是典型的螺甾皂苷类物质，有抗血小板聚集、改善学习记忆能力等作用[3,10]。有文献[11]的结果说明，知母皂苷AⅢ可以抑制肿瘤的生长。知母皂苷AⅢ抑制人脑胶质瘤增殖和生长[12]。知母皂苷AⅢ可以促进曲美替尼对肺癌A549细胞抑制活性[13]。知母皂苷AⅢ抑制白血病细胞HL-60增殖，促进细胞凋亡，并延长细胞周期[14]。知母皂苷AⅢ通过抑制PI3k/AKT信号通路的激活来抑制急性B淋巴细胞白血病细胞的生长发展[15]。知母皂苷AⅢ具有抗鼻咽癌增殖的作用功能[16]。本实验研究表明，与对照组比较，知母皂苷AⅢ明显下调组细胞A值、迁移数量和侵袭数量明显降低。潘会君等[17]研究结果，知母皂苷AⅢ能够抑制黑色素瘤B16细胞生长，并能诱导部分细胞发生凋亡，我们的结果与前人研究结果一致。

本实验研究发现，与对照组比较，知母皂苷AⅢ明显上调细胞miR-494表达水平。知母皂苷AⅢ调控黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭可能是通过调控miR-494的表达实现的。同时我们还发现与miR-NC组比较，miR-494组细胞A值、迁移和侵袭数量以及迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9表达水平明显降低。这提示，过表达miR-494可显著抑制黑素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭。 已经有研究报道与本实验类似，miR-494可以促进黑素瘤A375细胞凋亡，延长细胞的周期[18]。

已有研究显示，中药可通过调控miRNA的表达发挥其抗肿瘤功效。严淑等[19]发现甘草素可通过调控miRNA抑制人黑色素瘤A375细胞的侵袭转移。李燕华等[20]也在研究中证实中药白藜芦醇可通过调控miR-506的表达可抑制黑色素瘤的生物学表达。本研究结果表明，与anti-miR-NC+16 μmol/L组比较，anti-miR-494+16 μmol/L组细胞A值、迁移数量和侵袭数量显著升高。这提示，抑制miR-494表达逆转了知母皂苷AⅢ对黑色素瘤A375细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，这也证实了我们的猜想：知母皂苷AⅢ可通过调控miR-494的表达影响黑色素瘤A375细胞的生物学行为。

综上所述，知母皂苷AⅢ上调miR-494抑制原发性皮肤黑色素瘤增殖、迁移和侵袭，本研究为该疾病的治疗提供了一种治疗方式，有了一个新的靶标。