唾液：应用于运动训练领域的潜力生物样本

许毅枭，赵永才，高炳宏

（1. 上海体育学院 运动健康学院，上海 200438；2. 天津体育学院 社会体育与健康科学学院，天津 301617；3. 上海体育学院 竞技运动学院，上海 200438）

监控运动员对运动训练反应的常用指标来自血液和尿液样本。一些无创生理指标（如心率变异性、体成分、微循环等）也常被用于训练监控。唾液样本是无创、容易快速采集的生物样本，在运动训练领域具有较大发展潜力[1]。已有国内外文献报道了唾液在运动训练监控中的应用情况，但其仍未成为运动训练监控中的常用生物样本。目前，唾液样本中哪些生物标志物能够应用于运动训练监控，唾液生物标志物是否能及时、准确地反映运动训练对机体的影响，不同运动训练与唾液生物标志物的关系如何等尚不清楚，这限制了唾液样本在运动训练领域的应用。本文从唾液成分、唾液采集和检测方法、运动训练对唾液生物标志物的影响3个方面分析限制唾液生物标志物在运动训练中研究和应用的主要原因，以期为唾液在运动训练中的进一步研究和应用提供参考，帮助运动员、教练员、科研人员等更好地利用唾液样本开展训练监控等工作。

1 唾液成分

唾液是一种无色液体，密度在1.002～1.012 g/L，pH约为6.64[2]。唾液主要由低相对分子质量有机物质、激素和无机物组成。唾液中丰富的有机化合物主要由蛋白质、脂质等组成。唾液中的激素种类繁多，血液中的大多数激素能在唾液中进行测定，包括皮质醇、睾酮、脱氢表雄酮、雌激素以及醛固酮等。唾液中的无机化合物主要由离子组成，包括 Na+、K+、Ca2+、Cl-和HCO3-等。表1列出了唾液中常用于检测的部分有机化合物、激素和离子。多数物质在唾液中的含量是血液中的1/10～1/1 000，如唾液总蛋白质含量是血液中的约1/1 000，唾液睾酮含量是血液中的约1/100，唾液中Na+含量是血液中的约1/10。也有少数物质在唾液中和血液中的含量相似或高于血液中的含量，如唾液葡萄糖、皮质醇和血液中的含量相似，α-淀粉酶和K+含量在唾液中高于血液中。尽管大多数物质在唾液中的含量低于血液中，但近年来研究[3]发现，唾液中部分生物标志物及血液中相应生物标志物与运动训练的变化高度相关。

表 1 唾液和血液中部分物质正常范围含量比较[3-5]Table 1 A comparison of the normal range of the content between saliva and blood

唾液中多数成分由唾液腺分泌，健康成年人唾液腺每天分泌750～1 500 mL唾液，其次是由血液中的物质转移至口腔[6]。唾液腺分泌受自主神经的副交感神经和交感神经支配，副交感神经诱导的唾液腺分泌特征是唾液呈水样流动，引起唾液中有机化合物和无机化合物含量降低[2]；交感神经诱导的唾液腺分泌特征是唾液输出量较少，导致唾液中总蛋白质含量、离子含量等提升。安静状态下唾液腺以0.30～0.65 mL/min的速度分泌唾液到口腔中，而咀嚼或品尝含柠檬酸食物可以将唾液分泌速度增加到1.5～6.0 mL/min[7]。研究[2]报道，在超过乳酸阈值或大于60%最大摄氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）的长时间运动中，唾液流速显著降低，表明唾液流速可反映运动强度。

2 唾液采集和检测方法

唾液成分受众多因素影响，运动训练、昼夜节律、年龄、性别、体质量和进食等均会影响唾液的分泌量和成分[4]。标准化唾液采集和检测流程是获得可靠数据的前提。

2.1 唾液采集方法

目前唾液采集方法并未标准化，不同采集方法对结果的影响较大，各类方法的优缺点如表2 所示。研究常用的唾液采集方法是全唾液采样法，通过无刺激被动流口水或小刺激吐口水方式直接将唾液采集在小瓶中。拭子采样、唾液腺采样器采样和微萃取采样的采样量较少，但会对唾液腺造成额外刺激[8]。

表 2 唾液采集方法的优缺点比较[9-10]Table 2 Advantages and drawbacks of saliva collected methods

唾液生物标志物含量也受昼夜变化影响，如安静状态下唾液睾酮水平存在昼夜节律，8:00最高、20:00最低[11]，因此唾液采样应在每天同一时间段采集，以控制昼夜节律的变化。此外，运动后唾液生物标志物峰值出现的时间点也为唾液样本采集时间提供了依据，如唾液皮质醇的峰值约在运动后30 min出现[12]，提示可在运动后20 min左右进行采样以检测唾液皮质醇含量。

2.2 唾液检测方法

根据检测原理唾液检测方法主要分为免疫测试方法、分离方法和电化学方法。酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是检测运动员唾液样本较常用的免疫测试方法。分离方法主要包括液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）和气相色谱-质谱（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）等色谱、质谱联合分析方法。电化学方法包括安培法、伏安法和电化学阻抗谱等。不同唾液检测方法的优缺点如表3所示。

表 3 唾液检测方法的优缺点比较[5, 13-14]Table 3 Advantages and drawbacks of saliva detection methods

因易于操作且相对便宜，多数研究采用ELISA检测唾液样本中的类固醇激素和蛋白质。但ELISA基于抗体和特定分析物之间的化学结合反应进行分析，若抗体与结构相似化合物产生交叉反应则可能影响测试的准确性，如文献[15]报道，唾液中的皮质醇和可的松分子结构相似，这会干扰皮质醇的ELISA检测结果。此外，由于不同ELISA的设计可能不同，抗体分析物的相互作用也可能发生变化，影响ELISA检测结果。尽管已经开发了一些转换表用于比较常见的不同ELISA检测结果[16]，但Büttler等[17]将不同ELISA试剂盒转换后的结果和同位素稀释LC-MS测试结果进行比较，发现ELISA试剂盒转换后的结果并不精确。因此，ELISA并不适用于多数唾液生物标志物的检测，未来研究应尝试采用灵敏度和准确度较高的检测方法进行唾液分析。

近年来研究提出结合使用液相色谱（Liquid Chromatography，LC）或气相色谱（Gas Chromatography，GC）与质谱（Mass Spectrometry，MS）分析唾液生物标志物，可以提高选择性、灵敏性和准确性。GC-MS 因其极高的色谱分离能力和额外的质量选择分离能力在类固醇分析中具备良好的潜力[18]。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）通常与串联质谱联用，可以降低样本检测量。高效液 相 色 谱-串 联 质 谱 分 析（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）具备快速、可靠、高精确度的优势[19]。但目前仅有少数研究采用分离方法检测唾液样本，未来研究可以多尝试采用分离方法开展唾液样本研究，加快建立唾液样本评价体系。

在唾液检测中免疫测试方法和电化学方法可以结合使用[20]。电化学方法简便、溶剂消耗少，最常见的是伏安法、安培法和电位法等，具有小型化和便携的优势，为即时测量唾液生物标志物提供了可能[21]。此外，英国体育学院（English Institute of Sport，EIS）于2020年8月发布的唾液检测新技术Hormonix引起了广泛关注[22]。该技术具备快速、准确等优势，但测定的唾液生物标志物、检测方法和分析应用情况等尚不清楚，目前仅小范围地应用于英国优秀运动员。

3 运动训练对唾液生物标志物的影响

唾液采集具备无创、容易采集和感染风险低等优势[4]，其生物标志物可以较及时地反映运动训练对运动员的影响，避免过度训练，预防运动损伤和疾病，还可以缩短训练监控的周期，以便更精确地掌握运动员生理状态周期性变化规律。唾液生物标志物可评估训练强度和训练量，以及监控身体压力反应、肌肉损伤程度、免疫和炎症反应、氧化状态等（图1）[14]，此外，唾液容易采集和无创的特点便于兴奋剂筛查，但目前世界反兴奋剂机构官网上没有使用唾液样本进行兴奋剂检测的程序。近年来不同运动训练对唾液生物标志物影响的研究如表4所示。

图 1 唾液生物标志物在运动训练领域的应用Figure 1 The applications of saliva biomarkers in sport sciences

近年来研究[23]证明，唾液和血液中部分生物标志物与运动训练的反应有较强相关性，唾液样本能够用于运动训练监控[23]。Ngamchuea等[3]的研究报道了唾液中睾酮（r＞0.7）、皮质醇（r＞0.8）、醛固酮和胰岛素含量与血液中含量高度相关。类似研究[2]也表明，安静状态下唾液中睾酮（r=0.7～0.97）、皮质醇（r=0.89）与血液中含量高度相关，运动中和运动后的唾液皮质醇和血液皮质醇含量高度相关。可见，静息状态下唾液睾酮和皮质醇能代替血液反映机体的合成代谢状态，用于监控运动员的机能状态。近期还有研究[24-25]报道，唾液脱氢表雄酮、孕酮、α-淀粉酶、免疫球蛋白A、谷胱甘肽、尿酸等多种物质也与血液中含量有较强相关性。这些研究表明，唾液与血液中部分激素类物质和有机化合物含量有较强相关性，为唾液样本应用于运动训练提供了有利证据。

表 4 运动训练对唾液生物标志物的影响Table 4 Effects of exercise and training on saliva biomarkers

3.1 运动训练对唾液压力生物标志物的影响

训练和比赛会影响运动员的心理和生理压力反应[26]。心理压力是情绪的紧张水平[27]。生理压力来源于自主神经系统的激活以及下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活[28]，唾液睾酮、皮质醇和α-淀粉酶是反映运动员生理压力的常用唾液生物标志物。睾酮是雄激素的一种，属于类固醇激素，能促进合成代谢，可反映运动训练对机体合成代谢的影响。皮质醇是肾上腺皮质分泌的一种糖皮质激素，能促进分解代谢，可反映运动训练对机体分解代谢的影响。睾酮与皮质醇的比值能反映运动训练对机体整体恢复情况的影响[29]。不同强度、持续时间的运动训练和唾液采样时间点会影响唾液睾酮、皮质醇和α-淀粉酶的检测结果。唾液睾酮、皮质醇适用于评估高强度训练后运动员生理压力的变化，而唾液α-淀粉酶更适合评估有氧运动后运动员生理压力的变化。

短时间高强度运动后唾液皮质醇明显增加，运动强度越大，运动后唾液皮质醇含量越高。长时间高强度运动后唾液皮质醇增加，睾酮下降。Monje等[30]的研究报道了20名优秀长跑运动员单次高强度间歇训练后（以90% V ˙O2peak的强度完成10个4 min间歇跑）唾液皮质醇增加，睾酮水平保持稳定。Crewther等[31]研究发现，9名健康男性完成30 s Wingate 自行车测试后唾液睾酮和皮质醇显著升高，唾液皮质醇在运动后20 min达到峰值，唾液睾酮在运动后10 min达到峰值。此外，Leicht等[32]研究发现，运动强度越大，运动后唾液皮质醇含量越高。Peñailillo等[33]研究发现，足球比赛后9名足球运动员唾液皮质醇无明显变化，唾液睾酮含量下降30.6%，睾酮与皮质醇的比值下降64.2%。足球比赛时长通常为90 min，且运动强度较大，提示长时间高强度运动能降低唾液睾酮含量和睾酮与皮质醇的比值。

一些研究报道了高强度运动项目备赛期间唾液睾酮和皮质醇的变化。Pritchard等[28]在赛季备赛前、比赛开始前、比赛结束后分别对46名足球运动员采集唾液样本，发现运动员不同赛季阶段的训练安排、生活节律是影响唾液免疫球蛋白和皮质醇含量的主要因素。Guilhem等[34]在24名高水平田径运动员为期20周的备赛过程中，每周一同一时间点采集唾液样本，检测压力生物标志物如皮质醇、睾酮、α-淀粉酶和嗜铬粒蛋白A，发现唾液压力生物标志物对备赛期间的训练内容敏感。这些研究表明，已有运动队将唾液作为日常训练监控和长期跟踪测试的样本，这能为其日常的训练和备赛提供有用信息。

Thorpe等[35]发现，足球比赛后即刻唾液睾酮、皮质醇未显著变化。Crewther等[36]发现，71名举重运动员在模拟奥运会举重比赛后即刻的唾液皮质醇和睾酮未出现显著变化，而血液中皮质醇和睾酮有显著变化。这2项研究与类似研究结果不同，其原因可以通过激素动力学解释。唾液睾酮和皮质醇主要由血液转运至唾液，激素从血液转运至唾液需要一定时间。Thorpe等[35]和Crewther等[36]均是在比赛后即刻进行唾液采样，而Monje等[30]在运动后20 min进行唾液采样，Crewther等[31]更是在30 s Wingate自行车测试后多个时间点进行采样。由于睾酮和皮质醇从血液转运至唾液需要一定时间，唾液采样时间点会影响短时间高强度训练后唾液睾酮和皮质醇含量检测的结果，因此建议短时间高强度训练后间歇约20 min再进行唾液采样。此外，唾液脱氢表雄酮评价女性合成代谢水平比唾液睾酮更精确。Granger等[41]发现，血清与唾液中脱氢表雄酮水平之间存在很强的线性关系。由于女性唾液睾酮含量非常低， Filaire等[42]提议使用唾液脱氢表雄酮代替唾液睾酮，评估女性运动员的合成代谢水平。

有氧运动后唾液α-淀粉酶明显增加。作为交感神经活性增加的标志物，唾液α-淀粉酶可用作运动员压力反应的唾液生物标志物[43]。Ali等[44]发现，有氧运动后唾液α-淀粉酶含量明显增加。Capranica等[45]发现，长时间有氧训练结束后唾液α-淀粉酶的变化比唾液皮质醇更明显。类似研究[27]也得出同样的结果。唾液α-淀粉酶对有氧运动更敏感，可能是因为其由自主神经系统控制的唾液腺产生，而皮质醇等激素是从血液转运到唾液的。唾液α-淀粉酶是有氧运动后评估运动员生理压力变化的主要唾液生物标志物。

3.2 运动训练对唾液免疫标志物反应的影响

唾液中含有较多免疫标志物，唾液免疫球蛋白A（Salivary Immunoglobulins A，SIgA）是唾液分泌物中含量较多的免疫球蛋白，SIgA阻止病毒病原体通过黏膜进入人体，是上呼吸道的第一道防线和黏膜免疫的最佳指标[46]。监控SIgA水平能够预防上呼吸道感染，降低感冒发生的风险，并为训练负荷的管理提供参考。口腔黏膜中的其他免疫球蛋白包括唾液免疫球蛋白M（Salivary Immunoglobulin M，SIgM）和唾液免疫球蛋白G（Salivary Immunoglobulin G，SIgG）。与SIgA相比，报道运动训练对SIgM 和 SIgG影响的研究较少。

运动强度影响SIgA含量，高强度运动后SIgA明显下降。在日常足球训练课[35]、网球训练课[47]或一般力量训练[48]后，SIgA没有显著变化；而在70%VO2max下长时间骑自行车[49]、50 km越野滑雪比赛[50]和三项全能比赛[51]后，SIgA显著下降，表明长时间高强度运动后SIgA显著下降，而中低强度运动训练对SIgA影响较小。此外，急性高强度运动后，SIgA显著下降，但在运动后24 h内恢复正常水平[52]。SIgA含量也受到唾液流速的影响，唾液流速越大，稀释作用越明显；反之，唾液流速降低导致SIgA含量明显增加[2]，在分析SIgA时应控制好每次采集唾液的流速以控制变量。SIgA对运动强度较为敏感，急性高强度训练和长时间高强度训练后运动员的SIgA含量明显下降，而长时间中低强度训练后SIgA含量的变化较小。研究[6]发现，短时间高强度运动后运动员SIgG和SIgM水平没有明显变化，而 SIgA 水平下降，表明SIgG和SIgM对短时间高强度运动的敏感程度不如SIgA。2 h自行车骑行训练或曲棍球比赛后SIgG和SIgM 含量明显下降[2]，提示SIgM和SIgG可用于评估长时间训练后机体的免疫变化。

3.3 运动训练对唾液肌肉损伤生物标志物的影响

运动导致肌肉损伤的主要机制包括肌纤维损伤、钙稳态变化和炎症过程，肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）和天冬氨酸转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）是肌肉组织损伤的生物标志物[53]。肌肉损伤后CK、LDH和AST会从肌细胞中泄露至血液。这3种酶能在血液和唾液样本中进行测定[37]。CK是肌肉损伤的重要特异性标志物，但唾液CK的含量较低，可能是由于CK从血液传递到唾液限制了唾液中CK的含量[54]。Barranco等[37]报道了1场5人制足球比赛后11名足球运动员唾液和血液中CK的变化，发现赛后12 h唾液和血液CK达到峰值，唾液CK含量为50.9 U/L，血液CK含量为290 U/L，前者约为后者的1/6。González Fernández等[38]报道了3场7人制橄榄球比赛后27名运动员CK、LDH和AST含量的变化，发现比赛后三者在唾液中的含量发生不同程度的变化，其中AST变化最显著，在橄榄球比赛后男性和女性的AST含量都明显增加，且男性AST比女性增加幅度更大。此外，唾液AST含量与血液中相似，长时间高强度运动后的变化幅度甚至高于血液[37-38]。

唾液AST、CK和LDH能够用于评估长时间高强度运动后运动员的肌肉损伤程度，唾液AST是更为敏感的唾液肌肉损伤标志物。尽管如此，不同运动强度和类型对唾液肌肉损伤生物标志物影响的研究仍相对匮乏，需要更多研究探讨唾液中CK、LDH和AST能否用于评估不同运动后的肌肉损伤情况。

3.4 运动训练对唾液氧化状态标志物的影响

细胞代谢过程中会不断产生自由基，氧化应激是氧化还原能力和自由基产生之间的不平衡导致的生理反应[55]。Biagini等[39]对10名游泳运动员进行自行车递增负荷最大摄氧量测试，分析其对唾液样本中氧化应激标志物的影响。该研究采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定丙酮、2-丁酮、2-戊酮、丙醛、丁醛、己醛、丙烯醛等唾液氧化应激标志物，发现递增负荷运动期间唾液氧化应激副产物明显增加，运动后恢复阶段唾液氧化应激标志物急剧减少。氧化还原物质根据物质成分分为两类：一类是超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽预氧化酶等酶类物质；另一类是胆红素、尿酸、氧化还原谷胱甘肽、硫醇、白蛋白等非酶类物质[56]。Rodrigues De Araujo等[40]对32名足球运动员进行高强度间歇训练（7次40 m短跑变向冲刺，每次间歇25 s），分析其对唾液氧化还原生物标志物的影响。该研究采用分光光度法和ELISA分析总胆汁酸、丙二醛、谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和尿酸的变化，发现高强度间歇训练后仅有唾液尿酸水平显著下降，而其他标志物变化并不明显，表明短时间高强度间歇训练可短暂抑制氧化还原能力，唾液尿酸水平是对短时间高强度间歇训练更敏感的唾液氧化状态生物标志物。另一项研究[57]也发现，在后检测唾液中，尿酸是唯一变化显著的唾液氧化还原生物标志物，唾液尿酸约占唾液总氧化还原能力的60%～70%。因此，唾液尿酸是唾液样本中评估氧化还原能力的重要生物标志物之一[58]。

目前，不同运动强度和持续时间对唾液氧化状态影响的研究相对匮乏，唾液氧化应激标志物对不同运动训练的敏感程度还有待进一步证实，且运动员唾液中氧化状态生物标志物的正常阈值尚不清楚，还需大量研究建立唾液氧化状态生物标志物的评价体系，从而进一步探究不同运动训练对各项目运动员氧化状态的影响，获取更多运动员对运动训练适应情况的信息。

3.5 唾液样本用于兴奋剂筛查

兴奋剂检测主要使用尿液和血液样本，世界反兴奋剂机构制定了标准的血液和尿液样本采集、转移和检测程序，而唾液样本未被纳入兴奋剂检测的可用样本[59]。其首要原因是目标分析物在唾液中的含量较低，限制了唾液样本在兴奋剂检测中的应用。例如，内源性同化雄激素（endogenous anabolic androgenic steroids，AAS）在唾液中的含量单位为pg/mL，而在尿液中的含量单位为ng/mL，唾液中AAS的含量是尿液中的约1/1 000，对仪器的精确度和检测技术的要求非常高[60]。但随着分析检测仪器的发展，质谱色谱分析方法检测底物含量的极限已达到pg/mL单位，能够检测到唾液样本中兴奋剂的含量，未来可采用质谱和色谱分析仪检测唾液生物标志物的含量，为运动员唾液生物标志物含量的正常参考阈值提供数据支撑。

近年来研究表明，唾液样本能够应用于运动训练领域，可能也能应用于兴奋剂检测领域。但由于研究较为匮乏，多数唾液生物标志物含量的正常阈值还有待阐明。未来需要进一步探究运动训练与唾液生物标志物的关系，建立运动员唾液生物标志物的评价体系。

4 结论与展望

唾液样本含有丰富的生物标志物，无创的优势使其在运动训练中有广阔的应用前景。大多数物质在唾液中的含量是血液中的1/10～1/1 000，较低的底物含量对唾液检测方法的精确度要求较高。全唾液被动流口水是常用的唾液样本采样方法，唾液样本采样时间点和测试分析方法尚未标准化。唾液睾酮、皮质醇、α-淀粉酶、免疫球蛋白A、天冬氨酸转氨酶、谷胱甘肽、尿酸等多种唾液生物标志物含量与血液相应生物标志物含量有较高的相关性，为唾液压力、免疫、肌肉损伤和氧化状态生物标志物在运动训练中的应用提供了有力证据。短时间高强度运动后唾液皮质醇明显增加，运动强度越大，运动后唾液皮质醇含量越高。激素从血液转运至唾液需要一定时间，建议短时间高强度训练后间歇10～20 min进行唾液采样以检测唾液睾酮和皮质醇含量。长时间高强度运动后唾液皮质醇增加，睾酮下降。唾液α-淀粉酶对有氧运动更敏感，有氧运动后唾液α-淀粉酶明显增加。未来仍需大量研究探讨不同运动训练与唾液压力、免疫、肌肉损伤、氧化状态生物标志物的关系，建立唾液样本监控运动训练的采集、检测、分析和评价体系。

作者贡献声明：

许毅枭：设计论文框架，搜集、整理文献资料，撰写、修改论文；

赵永才：梳理论文，提出修改意见，指导修改论文；

高炳宏：提出论文选题，审核、指导修改论文。