黄芪汤含药血清对血管内皮生长因子诱导的大鼠肝窦内皮细胞增殖、迁移和成管能力的影响及其作用机制

王浩艺， 麦静愔， 平 键,3， 成 扬,3,4

1 上海中医药大学附属曙光医院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市光华中西医结合医院 治未病科， 上海 200052；3 上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室， 上海 201203； 4 上海市中医临床重点实验室， 上海 201203

肝纤维化是肝脏对多种病理刺激的自我修复反应。在该过程中，血管内皮生长因子(VEGF)表达上调，多种细胞因子激活肝星状细胞，使细胞外基质生成降解失衡、过度沉积。目前多数学者认为肝窦内皮细胞(LSEC)先于肝星状细胞激活，其持续去窗孔化、表型改变、形成内皮下基底膜，即肝窦毛细血管化，是肝纤维化、肝硬化的早期特征性病变[1-2]，由此伴随的内皮功能障碍和血管新生，会进一步加重肝纤维化的进展，并参与门静脉高压形成[3-4]。因此，如何抑制LSEC的增殖和血管新生对于肝纤维化、肝硬化的治疗具有重要意义[5]。

在肝硬化“虚损生积”理论的指导下[6]，本课题组前期临床研究[7]发现，黄芪汤可以改善乙型肝炎肝硬化伴轻、中度食管静脉曲张患者门静脉直径和食管静脉曲张Palmer评分。动物实验[8]成功复制胆管结扎大鼠肝硬化门静脉高压模型，发现黄芪汤可以显著降低门静脉压力，减少肝窦毛细血管化标志物的表达。基于此，本研究体外分离、培养大鼠LESC，进一步观察黄芪汤对LESC增殖、迁移和成管能力的影响并初步探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物 20只雄性SD大鼠，8周龄，体质量180～220 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005；实验动物使用许可证号：XYXK(沪)2020-0009。所有大鼠均饲养于上海中医药大学动物实验中心清洁级饲养室，饲养环境：22 ℃，12 h昼夜循环，自由进食饮水。适应性喂养3 d后进行实验。

1.2 细胞 分离的雄性SD大鼠原代LSEC。

1.3 药品 黄芪汤由黄芪30 g和炙甘草5 g组成，委托江苏江阴天江药业有限公司制作颗粒剂(批号：1212353)，1.2 g黄芪汤颗粒相当于黄芪生药量6 g、炙甘草生药量1 g。制备工艺如下：取饮片，加水煎煮二次，合并煎液，过滤。浓缩至一定相对密度的清膏，喷雾干燥，过筛。按照处方取以上提取物，混合30 min使之均匀。将以上混合物干法制粒，制成12～40目颗粒。采用空白铝箔袋喷印包装喷码，按照规格将颗粒包装成铝箔小袋。使用前配置成0.14 g/mL溶液(成人用量为6 g/d，体质量按60 kg计算，大鼠灌胃剂量等效约为人体14倍，因此换算为大鼠每天灌胃剂量1.4 g/kg)。

1.4 试剂与仪器 DMEM培养液、胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液、RIPA裂解液购于北京索莱宝科技公司，货号分别为：11995、S9030、P1400、R0010；BCA蛋白检测试剂盒、噻唑蓝(MTT)试剂盒、ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为：P0012、C0009S、P0018M；重组鼠细胞VEGF购于美国PeproTech公司，货号：400-31；Matrigel基质胶购于美国Corning公司，货号：356234；GAPDH抗体、血小板-内皮细胞黏附分子-1(CD31)抗体、内皮性一氧化氮合酶(eNOS)抗体、蛋白激酶B(AKT)抗体、磷酸化(p)-AKT抗体、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体、磷酸化(p)-mTOR抗体购于英国Abcam公司，货号分别为：ab9485、ab28364、ab5589、ab126811、ab8805、ab2732、ab63552；内皮素-1(ET-1)抗体购于南京安研生物科技有限公司，货号：NY-174490M；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购于英国Abcam公司，货号：ab97051。5415R型高速低温离心机(日本Olympus公司)；pectramax M5酶标仪(美国Molecular Devices公司)；DP80倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；041BR127719型电泳仪及转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 黄芪汤药物血清制备 随机选择SD大鼠10只，按照1.4 g/kg的剂量给予黄芪汤灌胃，另10只大鼠给予相同体积的蒸馏水灌胃。1次/d，连续3 d。第3天给药灌胃后2 h，无菌条件下腹主动脉取血10 mL，4 ℃静置2 h，离心制备血清(3000 r/min、20 min)，56 ℃灭活30 min，过滤，-80 ℃储存备用。此药物血清为高剂量组，1倍比稀释为中剂量含药血清，3倍比稀释为低剂量含药血清。

1.5.2 大鼠LSEC分离和培养 使用雄性SD大鼠用于分离原代LSEC，分离方法：将前灌流液、胶原酶溶液等置于37 ℃水浴预热，无菌硅胶管一端通过恒流泵与前灌流液瓶相连，另一端通过气泡管与穿刺针相连接。大鼠麻醉后，分别用碘酒、酒精消毒皮毛，U型剖腹术分层打开腹腔，暴露内脏。分离门静脉，在门静脉近肝门处围结扎线，门静脉穿刺，插入留置针，扎紧管口，开启恒流泵，流量为10～20 mL/min，迅速剪断下腔静脉，使肝脏变为均匀的淡黄色。分离肝脏，连同留置针悬挂于放有布氏漏斗的铁架台上，待前灌流液灌注约8 min后，开始灌注胶原酶溶液循环灌注20 min，待肝被膜下肝组织几乎液化后，快速剪下肝脏，转移至培养皿，剪碎后放入装有50 mL胶原酶溶液的硅化三角烧瓶中，加入4 mL DNA酶Ⅰ溶液，加酶配制液至100 mL。将烧瓶放入恒温水浴振荡器分散肝组织，200 r/min，37 ℃，20 min。振荡后将细胞悬液通过二层200目不锈钢筛滤至2根50 mL离心管中，将细胞悬液离心(900 r/min、5 min)，收集上清。然后将上清离心(1800 r/min、10 min)，收集沉淀；用PBS重悬沉淀后再次离心(1800 r/min、10 min)；再用10 mL PBS混匀沉淀，得到LSEC细胞悬液。沿离心管壁依次加入体积分数50%的percoll 15 mL，体积分数为25%的percoll 20 mL和10 mL细胞悬液，离心(2700 r/min、20 min)。小心吸取50%和25% percoll间的LSEC混浊带，加等量PBS，混匀，离心(2700 r/min、10 min)；将沉淀悬于10 mL 20% FBS DMEM培养基中，40 min后，收集未贴壁细胞悬液，再培养于另一培养瓶中，并进行细胞计数。LSEC采用含有10% FBS、1%双抗生素的DMEM培养液，置于37 ℃恒温、5% CO2培养箱中孵育。

1.5.3 LSEC分组和药物干预处理 LSEC分为6组：空白组，VEGF组，血清对照组，黄芪汤低、中、高剂量组(以下简称空白组、VEGF组、血清组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组LSEC均采用含有10% FBS、1%双抗生素的DMEM培养液培养。实验中各组LSEC药物干预处理方法如下：(1)空白组，予以上述培养液；(2)VEGF组，予以40 ng/mL的VEGF；(3)血清组，予以VEGF和10%空白血清；(4)低剂量组，予以VEGF和10%低剂量黄芪汤含药血清；(5)中剂量组，予以VEGF和10%中剂量黄芪汤含药血清；(6)高剂量组，予以VEGF和10%高剂量黄芪汤含药血清。

1.5.4 MTT检测 各组LSEC以1×104个/孔的密度接种于96孔板，予以100 μL上述培养液，37 ℃、5% CO2环境下培养48 h，然后20 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液，37 ℃恒温孵育4 h，弃去每孔残液，150 μL/孔加入二甲基亚砜。将96孔板置于摇床轻微摇动10 min，酶标仪检测490 nm波长的吸光值，计算细胞活力，细胞活力(%)=处理组细胞吸光值/对照组细胞吸光值×100%。

1.5.5 Transwell实验 各组LSEC悬浮于无血清培养液，密度为1×106个/mL。在上室(8 μm孔径)6孔插板上种植500 μL LSEC悬浮液；在下室添加600 μL(10% FBS和1%双抗生素)DMEM培养液。于37 ℃和5% CO2环境下孵育24 h，将迁移细胞使用4%多聚甲醛固定15 min，然后使用0.1%结晶紫染色15 min，漂洗，显微镜下观察、计数。

1.5.6 成管实验 将Corning凝胶基底膜基质(150 μL，10 μg/mL)预包被于24孔板，将密度为1×105个/孔的LSEC种植于24孔板，依照分组加入相应的培养液，37 ℃、5% CO2培养12 h后，在显微镜下观察LSEC，应用Image J软件进行血管生成长度测量。血管长度(%)=处理组细胞管长/空白组细胞管长×100%。

1.5.7 Western Blot检测 各组LSEC培养48 h后收集，使用RIPA裂解液抽提总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白含量，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜到PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下1 h进行阻断封闭，加入CD31(1∶1000)、eNOS(1∶1000)、ET-1(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶500)、mTOR(1∶1000)、p-mTOR (1∶500)、GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶2000)室温下2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用ECL发光液显影，采用Image J软件分析。

2 结果

2.1 黄芪汤含药血清对VEGF诱导大鼠LSEC增殖的影响 MTT检测结果显示：与空白组相比，VEGF组、血清组、低剂量组LSEC增殖均显著增加(P值均<0.05)；VEGF组、血清组、低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与血清组比较，中、高剂量组的LSEC活性显著下降(P值均<0.05)，其中高剂量组比中剂量组的细胞活力下降更为明显(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠LESC活力比较

2.2 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC迁移的影响 Transwell试验结果显示：与空白组相比，VEGF组、血清组的LSEC迁移数目显著增多(P值均<0.05)；血清组与VEGF组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；与血清组比较，低剂量组细胞的迁移数目明显增加(P<0.05)，而中、高剂量组细胞的迁移数目明显减少(P值均<0.05)(图1，表2)。

注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。

表2 各组大鼠LESC迁移细胞数目比较

2.3 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC成管能力的影响 成管实验结果显示：空白组LSEC几乎无管腔结构形成。与空白组相比，VEGF组、血清组能明显促进LSEC管腔结构形成，其成管节点数、交叉点数、血管长度均显著增加(P值均<0.05)；血清组与VEGF组成管能力比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与VEGF组、血清组相比，低剂量组对LSEC成管具有促进作用，可见管腔形成(P值均<0.05)，而中、高剂量组在成管节点数、交叉点数、血管长度方面均显著降低，较少有完整管腔形成(P值均<0.05)(图2，表3)。

2.4 黄芪汤含药血清对大鼠LSEC表达CD31、eNOS和ET-1的影响 Western blot检测结果显示：与空白组比较，VEGF组、血清组LSEC中CD31、eNOS和ET-1蛋白表达显著升高(P值均<0.05)；VEGF组与血清组蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与VEGF组、血清组比较，低剂量组CD31和eNOS蛋白表达差异不明显(P>0.05)，ET-1蛋白表达显著升高(P<0.05)；与VEGF组、血清组、低剂量组相比，中剂量组CD31、eNOS和ET-1蛋白表达水平均显著下降(P值均<0.05)；与中剂量组比较，高剂量组CD31、eNOS和ET-1蛋白表达水平均显著降低(P值均<0.05)(图3，表4)。

注：a，空白组；b，VEGF组；c，血清组；d，低剂量组；e，中剂量组；f，高剂量组。

表3 各组大鼠LESC成管能力比较

图3 各组大鼠LSEC中CD31、eNOS、ET-1、GAPDH蛋白表达

2.5 黄芪汤含药血清对AKT/mTOR信号通路的影响

Western blot检测结果显示：与空白组比较，VEGF组、血清组、低剂量组LSEC中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显增加(P值均<0.05)；VEGF组与血清组之间p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达的差异无统计学意义(P>0.05)；与低剂量组和血清组相比，中剂量组LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均明显下降(P值均<0.05)；与中剂量组比较，高剂量组LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著下降(P值均<0.05)(图4，表5)。

图4 各组大鼠LSEC中AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达

表5 各组大鼠LESC中AKT/mTOR信号通路蛋白表达比较

3 讨论

慢性肝病是全球面临的主要健康挑战之一，肝纤维化是慢性肝病进程中重要的病理阶段，决定了慢性肝病的发展和预后。如何控制、逆转肝纤维化成为慢性肝病治疗的关键。目前抗肝纤维化治疗尚未满足对预防慢性肝病进展为肝硬化、肝癌的需求[9-10]，在中医学整理观念和辨证论治原则指导下，探索、优化中医药抗肝纤维化的治疗方案，符合当前肝纤维化治疗的主流[11-12]。

表4 各组大鼠LESC中CD31、eNOS、ET-1蛋白表达比较

肝纤维化是肝脏损伤的阶段性病理改变，现代医学未将其归属于一个独立性的疾病，中医古籍亦无肝纤维化的病名记载，现多将其归属于“胁痛”“肝积”等范畴，其病因各异，但基本病机可归纳为“虚损生积”，即机体功能损伤，无以化气，因虚致瘀，因虚生积[13]。治积之要，张元素认为“当先养正则积自除”，强调扶助正气的重要性。黄芪汤出自北宋《太平惠民和剂局方》，由黄芪、甘草6∶1相虚配伍，黄芪益气扶正，且能活血生血，甘草缓气养阴血，且助黄芪益气补血，与肝纤维化病机相契合，补气癥自消，养正积自除，虚瘀同治，标本兼顾。

LSEC是肝窦内数目最多的非实质细胞群，在维持肝脏稳态方面发挥重要的作用，其结构和功能的改变常常是肝纤维化发生的初始事件[14]。众所周知，病理性血管的新生，既伴发于肝纤维化的发生，又能加速肝纤维化的进程。肝窦毛细血管化是肝脏微血管生成的主要形式，其发生能进一步加重肝脏微循环障碍，促进肝纤维化、肝硬化的发展及并发症的形成，使肝纤维化逆转更加困难。因此抑制肝窦毛细血管化和LSEC介导的病理性血管新生，可能成为肝纤维化防治的重要策略。生理状态下LSEC不表达CD31，随着肝窦毛细血管化发生，LSEC表型发生变化，CD31表达增加，因此CD31被认为是肝窦毛细血管化的标志物[15]。ET-1主要来源于内皮细胞，与内皮素受体结合促进内皮细胞的增殖和迁移，是内皮功能障碍的病理生理学基础[16]。研究[17]表明LSEC功能障碍和损伤后会合成及分泌丰富的ET-1，引起LSEC窗孔结构改变、缩小，促进肝窦毛细血管化[18]。VEGF是eNOS的激活剂，慢性肝病中VEGF表达升高，促进LSEC表达eNOS，引起内皮细胞增殖和血管通透性改变[19]，有利于长期局部血管的生成[1,20]。AKT是调控细胞增殖、分化和血管生成的重要信号分子，mTOR是其下游信号分子之一，AKT/mTOR信号通路的激活在细胞增殖、血管生成中发挥重要的作用[21]。

本研究以大鼠LSEC作为研究对象，以VEGF刺激LSEC来模拟肝纤维化发生时LSEC所处的病理环境，予以不同剂量的黄芪汤含药血清干预。结果显示，血清对照组中在VEGF诱导下可以促进LSEC增殖、迁移和血管新生，促进CD31、eNOS、ET-1蛋白表达和AKT/mTOR信号通路的激活，中、高剂量的黄芪汤含药血清可以抑制由VEGF诱导的LSEC增殖、迁移和血管新生，抑制CD31、eNOS、ET-1蛋白表达，该作用机制可能与抑制AKT/mTOR信号通路的激活相关。值得注意的是，黄芪汤对LSEC成管能力的影响可能与剂量相关，低剂量时可以促进血管新生，中、高剂量时可以抑制血管新生。关于黄芪汤对LSEC成管能力的影响更深层次的作用机制，本研究团队将在后续研究中进一步探索。

伦理学声明：本研究方案于2019年4月28日经由上海中医药大学实验动物伦理委员会审批，批号：PZSHUTCM2019041835，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：王浩艺参与课题设计，收集数据，资料分析，撰写论文；麦静愔、平键参与课题设计，收集数据，修改论文；成扬负责课题设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。