浚单玉米骨干系抗南方锈病及优异结实性分子机理探究

张文成 王良发 章慧玉 靳海蕾 张志方 李长建 张守林

（鹤壁市农业科学院 河南 鹤壁 458030）

玉米（Zea may L.）作为世界上最重要的粮食、饲料和能源作物之一，在保障我国粮食安全、促进经济发展及缓解能源危机等方面发挥着不可替代的作用[1]。近年来，极端灾害天气频发，玉米病害及热害已经严重威胁黄淮海地区玉米生产。

受热带气旋活动影响，以前主要在我国台湾、海南、广东、福建等省发生的玉米南方锈病，现已成为黄淮海夏玉米区突发性、暴发性、生产危害性极大的病害[2]。2015年和2021年，黄淮海地区大面积暴发了玉米南方锈病，产量损失严重，玉米南方锈病在我国由次要病害上升为主要病害[3]。对南方锈病抗性QTL和基因的鉴定与定位研究也在不断地跟进。我国科研工作者利用抗南方锈病玉米自交系材料和感病材料进行遗传分析，定位到多个玉米抗南方锈病主效基因位点，大多数位于10号染色体短臂[4-7]。最近，河南农业大学丁俊强教授课题组定位并克隆到一个玉米抗南方锈病主效基因RppC，并解析了RppC蛋白的抗病机理[8]。通过与感病材料Lx9801序列比对分析，发现该基因在Lx9801中存在多处变异，其中一个A碱基的插入导致RppC翻译提前终止。利用转基因方法验证了RppC的抗病效应。对从我国玉米主产区分离的577份田间病原菌进行测序分析，发现RppC能识别83.5%的AvrRppC结构位点，从而对当前南方锈病病原菌优势小种产生抗病反应，表明RppC是一个优异的抗病基因资源。并针对抗病材料CML496和感病材料Lx9801在RppC基因序列上的差异，设计特异引物用于检测RppC基因，若能扩增出条带，则为CML496-RppC类型。

玉米籽粒产量是一复杂的综合性状，直接受穗长、穗粗、行粒数、穗行数、粒长等影响。然而穗长、穗粗、行粒数、穗行数、粒长等性状又受到穗分化时花序分生组织（Inflorescence Meristem）活性影响[9-10]。玉米行粒数作为重要的产量构成因子之一，增加行粒数，可使单穗产量增加。迄今为止已鉴定出多个玉米穗长相关的QTL，但仅有少数基因被克隆，基因KNR6和YIGE1可通过调控穗长、行粒数来提高玉米产量[11-12]。研究发现，基因ZmACO2并不是直接通过调控行粒数来提高玉米产量，而是通过提高玉米幼穗顶部雌花育性来提高玉米产量[14]。基因ZmACO2是华中农业大学张祖新教授课题组克隆，参与花序发育进程中内源乙烯的生物合成。敲除ZmACO2基因，雌花序中内源乙烯的合成减少，雌性小花的败育率下降，结实率增加，单穗籽粒数增加，同时敲除ZmACO2基因也可使杂交种增产约13.4%。对单倍型Ye478和单倍型SL17基因序列分析发现，在基因编码区两单倍型没有序列差异，而是启动子区域4个SNP和1个InDel差异与败育率关联度高。启动子结构差异导致单倍型Ye478的ZmACO2基因表达少于单倍型SL17，从而引起乙烯及相关植物激素在两单倍型中表达差异，最终导致Ye478行粒数高于SL17、Ye478穗长度大于SL17。

鹤壁市农业科学院在玉米新品种选育过程中特别注重抗病性和结实性优异种质的选育。鹤壁市农业科学院玉米种质具有优良的结实性，在此基础上，近年来从我国南方引进了一批抗病种质材料。利用不同生态区域选育父本群和母本群的方法，选育出一批结实性好、抗病性强的优良玉米自交系，并组配出一批优良玉米新品种通过国家、省级试验审定。为了探究鹤壁市农业科学院玉米种质抗病性强、结实性好、配合力高的分子机理，特选用河南农业大学丁俊强教授课题组报道的抗南方锈病主效基因RppC特异引物、华中农业大学张祖新教授课题组报道的乙烯合成关键酶基因ZmACO2启动子区特异引物对鹤壁市农业科学院骨干系材料进行扩增、测序分析，找到相应的抗南方锈病、高结实率材料，便于以后分子标记辅助选择育种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

利用20份鹤壁市农业科学院自选系、1份苏艾自交系MD15及郑58、昌7-2、掖478为供试材料（表1）。

1.2 检测引物

参考Ce Deng等[8]发表的论文，选取表2中特异引物检测供试材料抗南方锈病基因RppC和调控雌花育性基因ZmACO2启动子区。

表2 试验所用引物名称及序列

1.3 试验方法

2022年6 月，在鹤壁市农业科学院园区种植玉米试验材料。7片展开叶时采集叶片，采用TPS法提取DNA。利用抗南方锈病基因RppC和调控雌花育性基因ZmACO2启动子区特异引物进行PCR扩增。取8 μl扩增产物电泳检测目的条带。将有扩增产物的对应PCR反应液送生工生物公司测序。

运用Dnaman软件进行序列比对分析。

2 结果与分析

抗南方锈病主效基因RppC扩增见图1，图1中编 号1～24对 应 表1中1～24号 自 交 系。利 用CML496-allele-speicific-F/R引物对24个玉米自交系进行PCR扩增，其中浚5036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚M9、浚351、浚JC125、MD15均扩增出588 bp条带（图1）。测序结果显示，12个自交系材料扩增序列与参考CML496-RppC基因特异序列完全一致（图2）。CML496-allele-speicific-F/R特异扩增抗南方锈病主效基因CML496-RppC原理见图2。在所选取的全部24个优良自交系中，有50.0%的材料具有RppC优异抗南方锈病基因资源；在所选取鹤壁市农业科学院20个骨干材料中，有55.0%的自交系含有RppC抗性基因。

表1 供试材料及所属类群

调控雌花育性基因ZmACO2启动子区PCR结果见图3，除浚SN12E、浚96、浚313、MD15、郑58外，其他19个材料均扩增出1 300 bp左右的目的条带。序列比对分析发现，所选取19个自交系的ZmACO2基因上游启动子区分为2种基因型，以掖478、浚M98为代表的见图4。与掖478序列相同的有浚5036、浚6366、浚6368、浚9058、浚6313、浚50X、浚3138、浚58、浚208A、浚3665、浚728、浚M9、浚G6Y6-2；与浚M98序列相同的有浚97、浚351、浚JC125、昌7-2。

3 讨论与结论

玉米南方锈病由多堆柄锈菌（Puccinia polysora Underw.）引起的真菌性病害，近年来，已成为黄淮海地区主要病害之一，导致部分地区玉米大幅减产[13]。尤其是2021年，黄淮海地区郑单958较早感南方锈病，产量锐减。通过考察各试验点参试品种，大多数品种均不同程度遭受南方锈病侵染，只有少数品种表现出较好的抗性。说明黄淮海地区育种家培育的抗南方锈病种质资源较少，开展抗南方锈病优异种质创制研究迫在眉睫。选育抗南方锈病种质是最经济、安全的应对方式。2003年，浚县农业科学研究所（2009年更名为鹤壁市农业科学院）承担国家黄淮海夏玉米区域试验，国外的M118和M119两个品种在试验中株型比较紧凑，与国内参试品种株型差异较大。浚县农业科学研究所在2004年夏天对2个杂交种选优株进行套袋自交，然后通过南繁北育、异地逆境选择，从M119中选育出优良自交系浚M9。用浚M9已经组配出国审和省审品种浚单509、浚单3136、永优618，均表现出高抗南方锈病。由于浚M9的一般配合力较高、抗南方锈病强的特点，鹤壁市农业科学院育种家利用群内改良的方法，将浚926（源于昌7-2和京7黄二环系）与浚M9杂交选育出浚M98、浚M97、浚96等系列高配合力自交系。但从大田生产观察到，浚M98、浚M97、浚96抗南方锈病能力不如浚M9，利用抗南方锈病主效基因CML496-RppC特异引物对CML496-allele-speicific-F/R在浚M98、浚M97、昌7-2上没有扩增出特异条带，推测浚M98、浚M97、浚96的RppC基因区段可能源自昌7-2。郑58、昌7-2均没有抗南方锈病CML496-RppC类型基因。从大田抗性观察，郑单958抗南方锈病较差。特异引物对CML496-allele-speicific-F/R能扩增出CML496-RppC类型基因序列，得到启示可以利用浚M9（塘四平头）为供体，以CML496-allele-speicific-F/R为分子标记，对昌7-2、浚M98、浚M97、浚M96进行精准回交改良。浚5036、浚6366、浚6368、浚6313、浚50X、浚58、浚208A、浚3665、浚351、浚JC125是鹤壁市农业科学院近年来新选育的优良自交系，大多数材料均利用先玉366的二环系与其他材料杂合选育而来。这个二环系主要优点是株型较好、抗病性强，推测上述材料的抗南方锈病基因源于先玉366二环系。MD15是福建省农科院生物技术研究所和贵州省农科院旱粮所合作选育的Suwan-Iodent（苏艾）种质自交系，目前在黄淮海地区已经组配出多个组合，具有较好的抗病性和抗逆性，苏艾热带种质可以作为黄淮海玉米育种的抗源供体[14-16]。

玉米结实性受花粉活力、花丝活力及雌花育性影响。对浚单系列玉米花丝活力研究表明，浚单系列玉米在吐丝后6 d授粉，花丝活力与对照相当，之后活力下降[17-18]。华中农业大学植物科学技术学院对浚M9进行花粉耐高温鉴定，结论是优于对照。在本试验中，除5个自交系外，其他19个自交系调控雌花育性基因ZmACO2启动子区PCR均扩增目标条带（图3）。将这5个自交系用玉米actin特异引物扩增，均扩增出相应条带，推测在这5个自交系G49-3-F/R引物区可能存在碱基变异，导致G49-3-F/R引物不能配对。掖478具有较低的败育率，从而使行粒数增加、穗长增加。调控雌花育性基因ZmACO2启动子区PCR及测序显示，13个自交系序列与掖478一致。这些自交系主要为瑞德、改良瑞德类，在育种上主要作为母本材料利用，制种产量较高。表明鹤壁市农业科学院杂交玉米结实性好是有多方面因素的，既有母本雌花育性高，又有父本花粉活力高，这些性状很好的遗传给了杂交后代。与浚M98序列一致的除浚351是PB种质，其他3个均是塘四平头种质，这也可能是生产上观察到部分作父本材料的塘四平头种质雌穗稍短的原因。当然，玉米穗长、行粒数受多个基因调控，本课题组将持续关注国际研究最新进展，以便将基础研究转化为应用研究，培育出更多优质高产玉米新品种。