5份大白菜叶卷曲突变体卷曲特性研究

张 楠， 赵姣姣， 崔维霞， 刘富强， 秦瑞鑫， 轩淑欣， 刘梦洋， 李 娜， 赵建军， 孙晓雪， 卢 银

(1.河北农业大学园艺学院/河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室/河北省蔬菜产业协同创新中心，河北保定 071000；2.保定市农业科学院，河北保定 071033)

叶片是植物进行光合作用，维持机体生长发育的主要器官。卷曲是叶片的一种特殊形态，受多基因互作、激素水平和外界环境因素的调控。叶片卷曲与作物生长发育密不可分，一方面叶片卷曲程度和类型的变化通过影响光合作用、蒸腾作用等重要生理生化反应，进而降低植物的生长发育及生物量的积累，导致多个叶片相关性状发生改变；同时叶片卷曲也是植物响应、反馈并适应外界环境的自我保护行为。对于大白菜、结球甘蓝等叶菜类蔬菜而言，叶片向内卷曲形成叶球是其典型的发育特征，叶球的形状、抱合方式、紧实程度等重要农艺性状均与叶片的卷曲形态、程度等息息相关，因此准确评价叶片卷曲、挖掘叶卷曲调控基因意义重大。

叶片卷曲属于立体的三维形态变化，卷曲程度、卷曲发生部位、卷曲方向等变化多样，仅通过肉眼观察和语言描述很难进行准确全面的评价，因当前技术条件有限，三维立体成像技术无法在大规模田间表型性状调查中广泛应用，因此须建立一个适于大规模开展、较目测更为准确的卷曲评价方法。水稻叶片卷曲评价的研究较多，水稻卷叶突变体、()、、、以及杂交水稻均以卷曲指数(LRI)评价叶片卷曲的程度。该指数也被成功地应用于花生和玉米的叶片卷曲的评价中。袁玉菊等则采用纵卷指数(LC)和侧卷指数(TC)分别评价拟南芥、甘蓝和结球甘蓝的叶片卷曲。Liu等用曲率指数(CI)评价拟南芥突变体的叶片弯曲。李平霞进一步将CI拓展为叶片横向卷曲度(CIT)和叶片纵向卷曲度(CIL)来评价白菜叶片的卷曲。总结分析发现，虽然这些卷曲指数的名称不同，但测量和计算方法具有一致性，因此该指数能够在一定程度上实现卷曲的快速、准确的评价。

影响叶片卷曲的因素众多，在能够准确评价叶片卷曲的基础上，探究卷曲形成因素首先应进行表型性状的调查分析，即明确叶片卷曲特点，观察分析叶片其他表型变化及二者之间的关系。如在以往叶卷曲的相关研究中普遍发现，叶卷曲突变体多伴有植株矮小、发育迟缓等不良表型。在众多表型中，叶片形状作为叶片最基本的形态特征与叶片卷曲是否存在必然的联系，在以往的报道中，因研究材料较少规律性不明显、遗传背景不一致等因素相关报道较少，因此有待进一步深入研究。

细胞是植物结构和功能的基本单位，叶片细胞结构主要包括上下表皮、栅栏组织和海绵组织等，这些细胞的状态和行为之间的相互作用最终决定了叶片的形态，因此观察叶片细胞结构变化也是叶片卷曲研究的重要方法。在玉米和水稻等禾本科植物叶片卷曲材料的细胞学变化研究中，发现泡状细胞大小和数量的变化是导致叶片发生卷曲的关键因素。在其他无泡状细胞的作物中，多认为细胞形态、极性、细胞的不均匀生长等是引起叶片卷曲的重要因素。Nath等在对金鱼草叶片边缘褶皱突变体的研究中，推测叶片中心区域的叶肉细胞分裂速度慢于叶边缘区域是叶片发生褶皱的原因。Nelson 等认为引起玉米突变体叶片向上卷曲的原因是叶片表皮细胞近远轴细胞发生了极性颠倒。史灵敏认为栅栏组织细胞间隙增大，贮水组织排列疏松是花生卷叶突变体发生叶片卷曲的直接原因。余琳认为叶片栅栏组织和海绵组织细胞形态一致，未正常分化，是拟南芥叶片内卷突变体与野生型具有不同叶片卷曲表型的原因。刘慧珊对比分析大白菜野生型和叶片内卷突变体的叶肉细胞，认为细胞分布不均匀，栅栏组织与海绵组织细胞较小且排列不规则是导致叶片发生内卷的原因。由于这些结果源于不同物种，且只是针对1份或几份材料的研究分析，因此未发现明确的规律性。

本研究以相同遗传背景下的大白菜野生型A03和5份不同叶卷曲突变体为试验材料，通过表型性状调查、卷曲指数测定、卷曲部位的叶片细胞结构观察，探讨突变体的其他变异表型、卷曲指数、叶片细胞结构变化、叶形指数及叶片不同部位叶长变化与叶片卷曲表型的关系，以期为叶片卷曲评价体系的建立、叶形和叶片细胞结构与卷曲表型的相关性研究提供思路，为卷曲调控基因的深入挖掘及互作研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以大白菜野生型A03和甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得5份不同叶卷曲突变体S59、S300、S313、S339、SL6为试验材料。于2020年8月8日在河北农业大学教学试验基地温室内进行播种和标准化育苗，9月3日定植于露地，缓苗后开始进行调查，每份材料成活30株以上，各株生长条件一致，四周设保护行，进行常规田间管理。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片相关表型性状的调查 表型性状调查参考GB/T 19557.5—2017《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 大白菜》(即大白菜DUS测试)，以苗期真叶、莲座期莲座叶和结球期最大球叶(不结球突变体选取相同叶位的叶片)为调查对象，通过观察和测量调查叶片相关的21个表型性状，其中可观测性状13个，分别为各时期叶片的卷曲情况，莲座期叶色、叶缘锯齿、叶缘褶皱、叶缘波状、茸毛，结球期株型、结球情况、球顶部包合状态，收获期中肋颜色、叶球颜色、球内叶颜色、中心柱形状。可测量性状共8个，分别为各时期的叶形指数(leaf shape index，简称LSI)，结球期株高、株展、外叶数，收获期叶球高、叶球宽、叶球质量及植株鲜质量，具体调查方法见表1。以叶片为测定对象的性状，测定3株，每株选取相同叶位3张叶片，共9个生物学重复，其他性状3个生物学重复。

表1 表型性状调查方法、分类标准及调查时期

1.2.2 卷曲指数测定 选取相同的叶片测定LSI，每份材料9个生物学重复，分别测量自然状态和压平状态下的叶长、叶宽，计算侧卷曲指数(CIW)和CIL，叶片向内(近轴侧)卷曲则卷曲指数为正值，叶片向外(远轴侧)卷曲时卷曲指数为负值，具体测定方法见表2和图1-A、图1-B。

表2 卷曲指数测量和计算方法

1.2.3 叶片卷曲部位的细胞观察 以LSI测定相同叶位叶片，3株生物学重复，选取具有明显卷曲表型且位置相同的部位[叶片两侧靠近叶缘1～2 cm处(图1-C)]制作石蜡切片。观察细胞结构并利用image软件统计叶片表皮细胞、栅栏组织和海绵组织的细胞层数、细胞厚度、细胞大小(以随机选取的10个细胞切面面积的平均值作为细胞大小)。计算海绵组织与栅栏组织厚度比(spongy tissue and palisade tissue cell thickness ratio，简称SPTR)=海绵组织厚度/栅栏组织厚度；叶片细胞厚度比(cellthickness ratio，简称CTR)=(海绵组织厚度+下表皮厚度)/(栅栏组织厚度+上表皮厚度)，分别计算莲座期和苗期的CTR、SPTR及侧卷指数(CIW)的比值()，并进行相关性分析。=/；=/；=/。

1.2.4 叶长叶宽变化与卷曲指数的相关性分析 选取未卷曲的新生叶片，将叶片最长和最宽位置分别记为L和W，将叶长和叶宽平均划分7等份，左侧和上侧记为L～L、W～W；右侧和下侧记为L～L、W～W(图1-E、图1-F)。以10 d为1个周期，分别于2020年10月5日至11月4日连续4次测定同一叶片不同部位的叶长、叶宽，并计算LSI、CIW、CIL和叶片中间较两侧叶长的差异Δ，ΔL-(L+L)/2，3个生物学重复。考虑叶形及叶片长度本身的差异，以第1次叶片未发生卷曲时的LSI、CIW及Δ为基础，分别计算第次较第1次测量LSI、CIW和Δ的变化，并进行相关性分析。Δ=(-LSI)/LSI；Δ=-；Δ-1=(Δ-Δ)/Δ。

1.3 统计分析

使用Excel和SPSS软件对上述表型和细胞学数据进行标准差计算、显著性分析及相关系数的计算。

加快农业发展、增加农民收入是农业、农村工作面临的首要问题和中心任务，也是农业、农村工作的出发点和落脚点。鉴于林芝市深入贯彻落实西藏自治区第九次党代会和西藏自治区农村工作会议精神，特别是西藏自治区领导的重要讲话精神和指示要求，笔者结合林芝市青稞生产实际就如何提高青稞产量提出自己的浅见。

2 结果与分析

2.1 叶片表型性状调查与变异分析

通过对3个时期的叶片卷曲表型观察发现，野生型A03在3个时期均表现为两侧稍内卷。突变体S59、S300、SL6在3个时期也表现为叶片两侧内卷且内卷程度大于A03，S339苗期呈现叶缘内卷，后期两侧内卷程度大于A03；S313苗期和莲座期表现为两侧稍内卷，结球期叶缘外翻(图2)。3个时期6份材料叶片两侧均有卷曲变化，通过观察发现苗期和莲座期叶片两侧向内卷曲程度表现为SL6>S59≈S339>S300>S313≈A03；结球期表现为 SL6>S59 ≈A03>S300≈S339>S313(外翻)。

计算LSI并参考国标中的分类标准，A03各时期的LSI介于1.3～1.7之间，叶形为倒卵形。SL6各时期的LSI介于1.83～1.86之间，且显著大于A03的LSI，叶形为长倒卵形。S313早期的LSI与A03的LSI无显著差异，仅结球期的LSI为1.90，且显著高于A03的LSI，因此早期为倒卵形，结球期变为长倒卵形(表3)。

表3 大白菜不同时期的叶形指数

在13个可观察表型性状中，野生型A03主要表现为叶缘大波，结球、包合方式为舒心。5份突变体仅在叶缘波状和结球性2个性状上发现表型突变，不结球突变材料共有4份，分别为S59、S300、S313、S339，其中S313虽然并未抱合成球但成熟期中部叶片排列紧凑，此外，S300出现叶缘中波变异(表4)。

在8个可测量性状中，5份突变体变异性状在 3～11个不等，其中S59、S300、S339、SL6等4份材料的株高、株展、 鲜质量均显著小于A03， 结球突变体SL6所有4个叶球相关的性状均显著小于A03(表4、表5)。

表4 表型性状调查与分析

表5 5份大白菜叶卷曲突变体的表型变异统计分析结果

2.2 以CI评价叶卷曲情况

分析6份材料3个时期的CIW和CIL，结果(图3)表明，野生型A03的CIL在3个时期均为0，突变体中2份材料的CIL具有数值，其中S313结球期的CIL为 -0.04，极显著小于A03，S339苗期的CIL为0.02，显著大于A03。CIW表现多样，A03在3个时期的CIW分别为0.13、0.25、0.31，呈现逐渐增加的趋势。突变体中S313结球期的CIW为-0.30，苗期、莲座期与野生型A03无显著差异；S59、S300、S339、SL6在苗期和莲座期的CIW均极显著大于A03，结球期仅SL6仍极显著大于A03，其余3份与A03无显著性差异。 根据不同时期的CIW由大到小排序，苗期和莲座期表现为SL6>S59>S339>S300>S313>A03，结球期表现为SL6>S59>A03>S300>S339>S313，与目测结果一致且两侧向内卷曲程度与CIW呈正相关。

2.3 大白菜突变体叶片卷曲部位细胞结构分析及相关性分析

2.3.1 叶片卷曲部位的细胞结构变异分析 比较分析A03和5份突变体卷曲部位叶片细胞的层数，结果表明，在细胞层数上，6份材料苗期和莲座期上下表皮细胞均为1层。S59、S313栅栏组织和海绵组织细胞层数与A03均无显著差异，且苗期和莲座期细胞层数基本一致。苗期S300、S339和SL6海绵组织的细胞层数均显著小于A03，莲座期3份突变体的细胞层数与A03均无显著差异(图4-A，表6)。

表6 不同时期细胞层数统计分析结果

比较分析叶片卷曲部位不同类型细胞厚度的差异，结果表明，6份材料的上下表皮细胞厚度差异不明显，仅2份突变体具有显著性差异，其中S59仅在莲座期栅栏组织的细胞厚度极显著大于A03；S339海绵组织的细胞厚度在苗期和莲座期均显著大于A03，栅栏组织的细胞厚度仅在莲座期极显著大于A03(图4-B，表7)。

表7 不同时期细胞厚度统计分析结果

表8 不同时期细胞大小统计分析结果

2.3.2 细胞结构变化与卷曲的相关性分析 通过分析叶肉细胞相关数据发现，5份突变体较野生型A03未发生不同细胞排列、结构或类型的明显变异，表皮细胞的层数、厚度及大小变化也不明显，而栅栏组织和海绵组织细胞厚度、大小及细胞生长速度变化明显，细胞层数也发生不同程度的变化，经研究发现细胞大小及层数变化与卷曲形态无明显相关性，而不同细胞或不同部位细胞的厚度比与卷曲表型存在一定联系，其关系表现为与的变化规律一致，计算相关系数为0.91，因此二者相关性较强。此外与的变化规律也具有一致性，相关系数为0.84，因此也具有一定相关性(图5，表9)。

表9 细胞厚度比、栅栏组织与海绵组织厚度比与卷曲变化的相关性分析结果

2.4 叶长叶宽变化与卷曲的相关性分析

2.4.1 叶片不同部位生长情况的变异分析 分析同一叶片4次测定的LSI数据，结果表明，除S313第4次测量叶形指数高达2.04外，S313前3次测定以及其余5份材料4次测定的LSI均介于1.31～1.65之间(表10)。

分析连续4次测量的L～L和W～W数据发现，6份材料不同部位长宽数值均呈现逐渐增加的趋势，L的叶长较两侧生长迅速，L～L生长趋势呈倒“V”形趋势，而叶宽W～W生长趋势呈较均匀的抛物线状，叶长长势与叶宽长势不同，因此叶形发生变化(图6)。比较4次测定3个周期的叶长和叶宽生长情况发现，6份材料均表现为第2周期生长最快，第3周期生长最慢，仅S313在第3周期仍保持较快的生长速度，可能与其卷曲形态的特定表达时期有关，即该时期S313开始出现叶片外翻表型。

2.4.2 叶形指数与卷曲指数的相关性分析 分析6份材料叶形指数(LSI)与CI的关系，计算表型调查数据中苗期、莲座期和结球期LSI与CIW的相关系数分别为0.62、0.29、-0.36，苗期和结球期LSI与CIL的相关系数分别为-0.17、-0.69(莲座期CIL均为0，无法分析)，相关性较弱(表10)。不同材料、不同叶位的叶片大小和形状差异的影响，计算同一叶片连续4次测定的LSI～LSI与CIW～CIW的相关系数分别为-0.35、-0.11、-0.03，相关性较弱(表10)。

表10 叶形指数与卷曲指数的相关性分析结果

以第1次未发生卷曲的LSI和CI为基础，进一步分析ΔLSI与ΔCIW的相关系数，分别为-0.28、-0.13、0.08，因此相关性也不大(表11)。除第4次测定S313的CIL有数值外，6份材料4次测定的CIL均为0，而LSI的大小变化各异，因此LSI与CIL无明显相关性。综上所述，未发现LSI与CI存在明显相关性。

表11 ΔLSI与ΔCIW的相关性分析结果

2.4.3 叶片不同位置叶长变化与侧卷指数的相关性分析 前期观察发现，叶片卷曲往往伴有叶片形状尤其是叶长的变化，本研究结果证实LSI与CI相关性不大，进一步分析叶片不同部位叶长变化与侧卷表型变化的关系，计算4次测定的3个Δ与Δ的相关系数，分别高达0.91、0.97、0.98(图7，表12)，因此可知L较两侧的叶长差变化与叶片侧卷程度变化相关性极强。

表12 叶形与侧卷指数的相关性分析结果

3 讨论与结论

表型性状调查结果表明，5份叶卷曲突变体变异表型数量为3～11个不等，分析发现在突变性状中除S300存在叶缘中波变异外，其他性状如不结球、株高、株展、鲜质量等与叶卷曲相关，推测叶片发生卷曲后有效光合面积降低，使突变体有机物积累能力变弱，生物量积累减少，从而伴有植株生长缓慢、矮小、叶片变小等性状。这与前人的研究结果相同，如陈亚同发现水稻叶卷曲突变体株高、鲜质量明显小于野生型；刘慧珊发现白菜叶卷曲突变体伴有植株矮小性状，叶长、叶宽显著小于野生型。此外，本研究试材为EMS诱变2次所得，多次诱变也是产生多表型变异的重要原因，在同一突变体库的其他研究中也有相似结果。

本研究以观察和卷曲指数2种方法评价野生型A03和5份突变体的卷曲形态，结果证实卷曲指数较目测可以在一定程度上更准确地评价叶片卷曲程度。余琳等在拟南芥、大白菜、水稻叶片的卷曲研究中均获得了相同的结论。然而该指数并不完善，本研究中6份材料因卷曲形态比较简单，CI规律可以比较，如遇到叶片两侧卷曲方向不一致(拧卷)或卷曲部位不规则等情况较难准确评价。此外由于测量计算相对较为耗时耗力，因此在大规模材料的田间调查中更先进、准确、便捷的叶片卷曲评价技术手段有待进一步开发。

在叶形、叶片细胞结构变化与叶片卷曲表型变化的相关研究中，受限于遗传背景差异或研究材料的数量，以往学者仅能获得1～2份叶卷曲材料的叶片形状、叶片细胞结构或比较2～3份材料间的差异，虽发现叶片卷曲多伴有叶形的变化，明确叶卷曲必然由叶片细胞变化相关，但如何相关却无人探讨。本研究中6份材料的遗传背景一致，环境条件一致，叶片两侧均具有内卷表型且CIW表现各不相同，石蜡切片取材的叶片部位基本一致且均为卷曲发生部位，因此是研究叶形及叶片细胞结构变化与卷曲表型变化规律的良好材料。本研究也分别获得了阶段性的创新研究结果，为卷曲的深入研究奠定了基础。但本研究中仅分析了侧卷部位一个位置的细胞变化，虽然不同细胞厚度变化与卷曲表型具有较强的相关性，但无法判断是否为直接引起叶片卷曲表型变化的原因，需要进一步对比分析卷曲部位和未卷曲部位的细胞结构差异，以探讨引起突变体不同叶片卷曲表型的具体细胞结构变化成因。此外，本研究结果源于遗传背景相同的6份大白菜，在不同作物、不同背景或数量规模较大的群体中是否成立有待进一步研究。