小麦TaAlaAT基因的克隆及镉胁迫下表达分析

于永昂， 张夏冰， 张 蕾， 睢晓湉

(1.河南科技学院生命科技学院，河南新乡 453003； 2.河南科技学院现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡 453003)

近年来，我国农业产业结构发生了重大调整，为了进一步提高我国粮食作物的产量，在田间生产过程中化肥和农药的使用越来越多，导致我国自然环境中重金属污染越来越严重。最新的研究结果表明，在众多重金属污染中，镉(Cd)污染占首位，并且其已经被世界卫生组织确定为食物污染物。Cd是生命非必需元素，容易被植物吸收和积累后通过食物链最终进入人体，诱发神经痛、内分泌失调等多种病征，对人的身体健康造成极大危害。因此，Cd污染问题已经成为我国土壤生态安全和制约农业健康可持续发展的重要因素。降低土壤Cd污染含量和缓解Cd对植物的毒害作用，已经成为当前研究的一个热点问题。目前，许多研究者已经在玉米、大豆、水稻、烟草、花生等多种粮食作物和经济作物中开展了Cd对农作物质量影响的相关研究，并取得了一定成果。然而，与水稻等植物相比，小麦Cd污染相关研究还较少，尤其是关于其对Cd的吸收、转运和积累的机制还不十分清楚。因此，深入研究小麦的耐镉机制，进一步创制耐Cd或籽粒低Cd积累小麦新种质用于改良我国小麦的抗镉水平及粮食安全都有着非常重要的现实意义。

丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)别称谷丙转氨酶，是植物碳氮代谢过程中的重要酶类，能够催化丙氨酸、α-酮戊二酸形成丙酮酸、谷氨酸。基因在植物中能够参与光呼吸等生理代谢途径及抗逆性反应等。Son等在研究黍稷叶肉细胞、维管束鞘细胞时发现，其细胞的细胞质中能够检测到AlaAT活性，因此他们认为AlaAT在黍稷细胞中可能具有丙酮酸转运的功能。在小麦中的相关研究发现，从小麦黄化苗中能够检测到AlaAT，将黄化苗恢复在光照条件下培养后发现其酶活性显著增加，表明恢复光照后，在小麦植株转绿过程中该酶发挥了重要作用。在低氧环境下，拟南芥基因的表达量显著增高，而水稻中的基因也能够响应低氧胁迫。茶树基因能够响应高温、低温、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)等胁迫。以上研究结果表明，基因能够在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要的作用，深入研究该基因功能对于培育抗逆作物品种具有非常重要的意义。

本研究采用mRNA差异显示技术(differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)和 RT-PCR 技术对小麦的基因进行克隆，利用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中及镉胁迫处理后的表达水平，以期为全面解析基因在小麦中的功能提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本试验于2020年1—10月在河南省粮食作物基因组编辑工程技术中心开展，供试小麦品种为百农矮抗58。将小麦种子用无菌水冲洗3～5次后铺于培养皿中，于温度25 ℃、光—暗周期16 h—8 h的条件下培养14 d。选取生长一致的小麦幼苗，用1.0 mmol/L CdCl处理2、4、6、8、12 h后取样，以用纯净水处理的小麦作为对照，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中备用，以上每个处理均设3个生物学重复。

1.2 试验方法

1.2.1 DDRT-PCR分析和差异片段回收 以锚定引物H-T11A作为反转录引物，将镉胁迫组和对照组的小麦叶片用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的试剂盒提取总RNA，参照PrimeScript Reverse Transcriptase(TaKaRa)使用说明书合成第1链cDNA，以第1链cDNA为模板，用H-T11A锚定引物与8个随机引物(SP1～SP8，序列见表1)组合的8对引物进行RT-PCR扩增。通过电泳检测挑选差异性条带后，经DNA纯化回收试剂盒回收后送至金斯瑞生物科技股份有限公司测序。

表1 用于小麦DDRT-PCR的引物序列

1.2.2 差异基因序列扩增与生物信息学分析 将获得的测序结果在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行比对，发现1个与差异基因序列高度同源的基因序列(GenBank登录号：AK455865)，对该序列进行分析后发现其含有1个完整的开放阅读框(ORF)，编码谷丙氨酸转移酶蛋白，因此将该基因命名为。根据所获得的基因序列设计特异性引物：-F，5′-A C A C C C A C C T T T C C C C T C-3′；-R，5′-T A T C A A G C A T A G C A A C C A-3′。以小麦叶片cDNA为模板进行PCR扩增，用NCBI网站的相关程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对获得的核苷酸、蛋白质序列进行BLAST比对搜索；用MEGA 6.0构建进化树。

1.2.3 Cd胁迫下基因的表达分析 根据测序所得序列设计特异性定量引物：qRT--F，5′-G A G A G G G A C G G G A T T T T G-3′；qRT--R，5′-G C T T C A C T C A G G C A T T G G-3′。以小麦的基因作为内参基因(-F：5′-C T T G T A T G C C A G C G G T C G A A C A-3′；-R：5′-C T C A T A A T C A A G G G C C A C G T A-3′)。qRT-PCR反应所用仪器为Roche的LightCycler 480，PCR反应所用酶为TaKaRa公司的SYBR Green Master Mix。用2-ΔΔ法分析试验数据。同一处理所用的样品数为3个，每次对同一样品进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 小麦差异片段的分离与回收

采用1个锚定引物和8个随机引物，共8对引物进行DDRT-PCR反应。电泳结果表明，与对照相比，经Cd处理后获得1个表达量增强的条带(图1)，推测该PCR产物可能响应了小麦的Cd胁迫处理，因此将该条带进行切胶回收纯化。

2.2 TaAlaAT基因全长的获得及序列分析

差异表达片段测序结果表明，该片段大小为274 bp，在GenBank数据库中进行BLASTx对比发现，该片段与基因的相似性很高，根据筛选获得基因序列设计特异性引物，以小麦叶片cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩展得到1个1 500 bp左右的条带(图2)。测序结果表明，该片段全长 1 628 bp，包含1个长度为1 440 bp的完整ORF，编码479个氨基酸(图3)。蛋白质分析结果表明，该蛋白质的相对分子量为53.41 ku，理论等电点为6.97，化学方程式为CHNOS。不稳定指数为41.84，属于不稳定蛋白；脂肪指数为85.91，总平均疏水性(GRAVY)为-0.220，为亲水性蛋白。用在线工具SignalP 3.0、TMHMM分析发现，该蛋白的N端不含信号序列，有跨膜结构域(位置为109～131 bp)。用在线工具SOPMA对其进行二级结构预测发现，该蛋白的二级结构由36.12% α-螺旋(alpha helix)、31.32%无规则卷曲(random coil)、21.50%延伸链(extended strand)和11.06% β-转角(beta turn)组成(图4)。对小麦基因保守域的预测结果显示，第83～464位含有1个典型的AAT-like保守结构域(图5-A)，表明TaAlaAT属于天冬氨酸转氨酶家族。

此外，多重序列比对结果表明，小麦TaAlaAT与拟南芥(NP_173173)、油菜(XP_013641560)、烟草(XP_016466182)、水稻(AAO84040)和玉米(AAC62456)的一致性为70.23%(图5-B)。用MEGA 6.0构建进化树的结果显示，TaAlaAT与水稻OsAlaAT的亲缘关系最近(图6)。

2.3 TaAlaAT基因表达模式分析

为了进一步研究基因的时空表达模式、同组织部位的表达模式，采用qRT-PCR方法分析基因在小麦根、茎、叶、 雄蕊和雌蕊中的表达模式。由图7可以看出，该基因在小麦不同组织中都有一定程度的表达，但表达量不同，表达量由高到低排序为叶>茎>根>雄蕊>雌蕊。在镉胁迫下对基因进行分析发现，随着胁迫时间的延长，基因的表达量呈现先增高后降低的趋势，在处理4 h时基因的表达量最高，随后逐渐降低，在处理12 h时恢复至对照水平(图8)。由此推测，基因在小麦响应镉胁迫中起着一定作用。

3 结论与讨论

丙氨酸转氨酶是一种以磷酸吡哆醛为辅酶的转氨酶，其催化的可逆反应中可用的底物包括在碳代谢中起关键作用的戊二酸、丙酮酸以及参与氮同化和信号转导的谷氨酸，丙氨酸转氨酶在碳氮代谢过程中起着关键作用，能够帮助植物抵御外界胁迫。本研究采用DDRT-PCR技术和RT-PCR技术成功获得了小麦基因，对由该基因推导的蛋白保守结构域进行分析发现，该蛋白属于天冬氨酸转氨酶超家族。多重序列比对结果表明，基因编码的氨基酸序列与其他植物AlaAT蛋白质的氨基酸序列具有很高的相似度，包含磷酸吡哆醛倚赖转移酶Ⅰ、Ⅱ和氨基酸转移酶Ⅰ、Ⅱ等结构及C-末端过氧化物酶体靶标信号位点PTS。组织表达模式分析发现，小麦基因的表达具有组织特异性，在小麦叶片中的表达量最高，其次是在小麦茎、根中，在雌蕊、雄蕊中的表达量最低。qRT-PCR结果表明，基因表达量在镉胁迫后呈现先增加后降低的趋势，说明基因能够响应镉胁迫处理，推测其能够参与植物镉胁迫过程。非生物胁迫会导致植物在氮化物合成过程中积累过多的氨，而氨含量的过多积累会造成细胞膜损伤，进而影响到植物的生长发育。研究发现，高温胁迫后，水稻叶片中游离氨基酸的含量会增加，而游离氨基酸在一定条件下可以维持植物细胞的正常水势，并在一定程度上降低细胞的毒性效应。另外，茶叶基因能够响应高温胁迫。在小黑杨中过表达基因能够提高转基因株系谷丙转氨酶酶活性，1 mmol/L 硝态氮能够促进转基因植株根、叶片中基因的表达。同时，与氮代谢相关的、、、和等基因的表达量增加。在甘蔗中过表达大麦基因能够提高转基因植株在低氮条件下的氮素利用率。在缺氧、低氮和弱光条件下，小麦幼苗地上部分的丙氨酸及其同系物谷氨酸的含量高于地下部分，表现出较高的耐性。因此，研究氮素含量与植物耐逆性之间的关系对于研究植物抗逆性机制具有重要意义。

目前，对小麦氮代谢的研究主要集中在不同氮代谢关键酶活性与氮吸收、积累等方面，对小麦谷丙氨酸转移酶基因的研究还较少。因此，深入研究小麦基因的分子作用机制，对于揭示其在小麦碳氮代谢及抵御胁迫中的作用和机制有重要的理论意义。