p-mTOR、p-4EBP1 及p-S6K1 在结直肠腺癌组织中的表达及临床意义

曹李，陈鹏，李丁昌，董光龙*

1.南开大学医学院，天津 300071；2.解放军总医院第一医学中心普通外科医学部，北京 00853

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发生发展是多种因素参与、多阶段演进的极其复杂的生物学过程[1,2]，其中基因组的不稳定、遗传学组件改变等因素可导致其蛋白翻译异常，出现增殖失控而致癌。已知信息不足以充分描述其生物学特征及解释所涉及的分子信号通路。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种高度保守并广泛表达的丝/苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族的一员，是哺乳动物细胞内多种信号转导的重要枢纽，是细胞生长和增殖的重要调节因子。mTOR 信号通路异常激活后具有促进细胞增殖、抗凋亡、促进血管生成及促癌细胞转移等作用[3]。mTOR 主要通过调节哺乳动物的蛋白质翻译过程发挥作用，真核细胞始动因子4E 结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）和核糖体S6 蛋白激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）作为mTOR 的直接底物，参与调控蛋白质合成、细胞生长、增殖、细胞代谢等反应。mTOR 激活后可使4EBP1 和S6K1 蛋白磷酸化而表现出不同的生物功能[4]。磷酸化后的4EBP1 失去与真核细胞翻译启动因子（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）结合的能力而无法抑制蛋白质的表达；磷酸化后的S6K1 可使核糖体S6 蛋白激活，增加含嘧啶序列mRNA 的翻译能力，表达的蛋白常是一些核糖体蛋白和翻译调节蛋白。可见，4EBP1对细胞的生长起到负向调节的作用；而S6K1 对细胞的生长起到正向调节的作用[5]。随着mTOR/4EBP1/S6K1 信号传导通路在胃癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤疾病发生发展过程中作用机制报道的增多，p-mTOR 及其下游分子p-4EBP1 和p-S6K1 在结直肠癌组织中表达的情况及意义值得进一步探讨和证实。结直肠癌病理类型以腺癌最为多见，排除其他及特殊类型结直肠癌，本研究运用免疫组织化学方法探索pmTOR 及其下游分子p-4EBP1 和p-S6K1 在结直肠腺癌肿瘤组织及肿瘤旁组织中的表达情况及三者之间可能存在的联系，分析其与患者临床病理特征之间的关系，为了解其在结直肠腺癌发生发展中的作用及影响提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本 选用2013年10月至2018年8月就诊于中国人民解放军总医院医院普通外科行结直肠癌根治术患者的结直肠癌组织石蜡包埋标本60例及癌旁正常组织（肿瘤边缘2 cm）40例。

1.1.2 入组及排除标准 入组标准：①具有完整的病历资料；②术前未经新辅助放、化疗；③经手术治疗、病理证实为结直肠腺癌、留有完整组织标本；④未合并其他恶性肿瘤。排除标准：①临床病历资料不完善；②术前经任何其他治疗，可能影响客观条件者；③合并其他恶性肿瘤；④标本组织少或家属要求保留标本者。

1.1.3 临床病理资料 入组60例结直肠腺癌患者，其中男性38例，女性22例，年龄32～82 岁，中位年龄61.5 岁；右半结肠腺癌5例，左半结肠腺癌20例，直肠腺癌35例；淋巴结转移23例，无淋巴结转移37例；临床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例，Ⅳ期0例；低分化10例，高中分化50例；大体分型：隆起型23例，溃疡型20例，浸润型17例，均无远处转移。

1.2 研究方法

1.2.1 实验检测 应用MaxVision 法分别检测结直肠腺癌及癌旁组织标本中p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1 的表达情况。本次实验标本均经过甲醛固定液固定，75%、85%、95%酒精充分脱水，透明，浸蜡，并常规石蜡包埋。严格按照说明书操作，以0.01 mol/L 的PBS 替代一抗作为阴性判断标准，并设立为对照组；阳性标准为镜下观察到细胞质或／和细胞核中出现棕色颗粒。

1.2.2 结果判定 由2 名高年资病理科医师采用双盲法各自判读，参照Naoki 法：阳性细胞数0 为（-）；0～20%为（±）；20%～80%为（+）；＞80%为（++），（-）和（±）为阴性，（+）和（++）为阳性。不一致结果经商讨得出统一结论。

1.3 统计学分析

本实验所有数据采用SPSS25.0 软件进行处理。以频数表示计数资料，用均数±标准差（）表示计量资料，各组间的阳性率比较采用四格表卡方（2）检验，各组间阳性率的相关性采用Spearman 相关分析检验，以α=0.05 为检验水准，P＜0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p-mTOR 的表达情况及其与临床病理特征的关系

p-mTOR 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织中的表达情况见图1。其表达阳性呈现棕色，主要定位于细胞浆。在结直肠腺癌组织中p-mTOR 的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在高中分化及低分化结直肠腺癌组织中mTOR 蛋白表达阳性率分别为46.00%（23/50）和80.00%（8/10），差异具有统计学意义（P＜0.05）。在TNM 分期中，Ⅰ～Ⅱ期结直肠腺癌组织中mTOR 蛋白的表达阳性率为37.14%（13/35）；Ⅲ～Ⅳ期结直肠腺癌组织中mTOR 蛋白的表达阳性率为72.00%（18/25），两组差异存在统计学意义（P＜0.05）。在有淋巴结转移和无淋巴结转移组中mTOR 蛋白表达阳性率分别为69.57%（16/23）和40.54%（15/37），两组差异存在统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 p-mTOR 的表达情况及其与临床病理特征的关系Tab.1 Expression of p-mTOR and its relationship with clinicopathological features

图1 p-mTOR 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织中的表达情况A：癌旁正常组织 p-mTOR 阴性 B：癌旁正常组织 p-mTOR 阳性 C：结直肠腺癌组织 p-mTOR 阴性 D：结直肠腺癌组织p-mTOR 阳性Fig.1 Expression of p-mTOR in mucosal tissues and adjacent normal tissues of colorectal adenocarcinomaA: normal adjacent tissue,p-mTOR negative； B: normal adjacent tissue,p-mTOR positive；C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-mTOR negative；D: colorectal adenocarcinoma tissue,p-mTOR positive

2.2 p-4EBP1 的表达情况及其与临床病理特征的关系

p-4EBP1 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织表达情况见图2。阳性表达呈棕色，主要定位于细胞质。在结直肠腺癌组织中p-4EBP1 的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而p-4EBP1 的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移、TNM 分期、分化程度等未见相关，其差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 p-4EBP1 的表达情况及其与临床病理特征的关系Tab.2 Expression of p-4EBP1 and its relationship with clinicopathological features

图2 p-4EBP1 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织表达情况A：癌旁正常组织p-4EBP1 阴性 B：癌旁正常组织p-4EBP1 阳性 C：结直肠腺癌组织p-4EBP1 阴性 D：结直肠腺癌组织p-4EBP1 阳性Fig.2 Expression of p-4EBP1 in mucosal tissues and adjacent normal tissues of colorectal adenocarcinomaA: normal adjacent tissue,p-4EBP1 negative；B: normal adjacent tissue,p-4EBP1 positive； C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-4EBP1 negative；D:colorectal adenocarcinoma tissue,p-4EBP1 positive

2.3 p-S6K1 的表达情况及其与临床病理特征的关系

p-S6K1 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织表达情况见图3。阳性表达呈棕色，主要定位于细胞质。在结直肠腺癌组织中p-S6K1 的表达明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在高中分化结直肠腺癌组织中S6K1 蛋白表达阳性率明显高于低分化，差异有统计学意义（P＜0.05）。在TNM 分期中，Ⅰ～Ⅱ期结直肠腺癌组织中p-S6K1 表达阳性率为45.71%（16/35）；Ⅲ～Ⅳ期结直肠腺癌组织中p-S6K1 表达阳性率为72.00%（18/25），两组差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

图3 p-S6K1 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织表达情况A：癌旁正常组织 p-S6K1 阴性 B：癌旁正常组织 p-S6K1 阳性 C：结直肠腺癌组织 p-S6K1 阴性 D：结直肠腺癌组织p-S6K1 阳性Fig.3 Expression of p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma mucosal tissues and adjacent normal tissuesA: normal adjacent tissue,p-S6K1 negative； B: normal adjacent tissue,p-S6K1 positive；C: colorectal adenocarcinoma tissue,p-S6K1 negative；D: colorectal adenocarcinoma tissue,p-S6K1 positive

表3 p-S6K1 的表达情况及其与临床病理特征的关系Tab.3 Expression of p-S6K1 and its relationship with clinicopathological features

2.4 结直肠腺癌组织中p-mTOR、p-4EBP1 和p-S6K1三者表达的相关性分析

本实验mTOR 蛋白表达阳性的31例结直肠腺癌粘膜组织中4EBP1 蛋白表达阳性的有19例；31例4EBP1 蛋白阴性表达的结直肠腺癌粘膜组织中mTOR 蛋白表达阴性的有19例，应用SPSS 软件中Spearman 秩相关系数分析计算，结果示它们之间的阳性表达有一定的正相关趋势（r=0.268，P=0.038，P＜0.05）。31例mTOR 蛋白表达阳性结直肠腺癌粘膜组织中S6K1 蛋白表达阳性的有24例；26例S6K1 蛋白表达阴性结直肠腺癌粘膜组织中mTOR 蛋白表达阴性的有19例，应用SPSS 软件中Spearman 秩相关系数分析计算，结果示它们之间的阳性表达有明显的正相关趋势（r=0.433，P=0.001，P＜0.05）。见表4。在34例S6K1 蛋白表达阳性的结直肠腺癌粘膜组织中4EBP1蛋白表达阳性的有18例；在31例4EBP1 表达阴性的结直肠腺癌粘膜组织中S6K1 蛋白表达阴性的有15例，应用SPSS 软件中Spearman 秩相关系数分析计算，结果它们之间的表达无明显的相关趋势（r=0.105，P=0.423，P＞0.05）。见表5。

表4 p-mTOR 表达阳性的结直肠腺癌组中p-4EBP1 及p-S6K1 的表达情况及相关性分析Tab.4 Expression and correlation analysis of p-4EBP1 and p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma group with positive p-mTOR expression

表5 p-4EBP1 表达阳性结直肠腺癌中p-S6K1的表达情况及相关性分析Tab.5 Expression and correlation analysis of p-S6K1 in colorectal adenocarcinoma with positive p-4EBP1 expression

3 讨论

结直肠癌是世界第3 大恶性肿瘤，列于肿瘤致死性疾病的第4 位。多数结直肠癌被确诊时已处于中晚期，淋巴转移、远处转移亦属常见，治疗以开腹或腹腔镜等手术为主、放化疗为辅助，但患者生存期改善有限，中位生存时间在20 个月左右[6]。目前结直肠癌的发病机制尚不明确，如何从基因层面，分子水平达到预防、治疗甚至攻克癌症是当前的研究重点。PI3K/AKT/mTOR 信号通路为最新研究热点之一[7,8]，该信号通路对多种良恶性肿瘤的发生发展起着关键的作用及影响[9,10]，如甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、胃结直肠癌、肾癌和宫颈癌等以及相关的良性肿瘤组织病变。mTOR 信号通路的活性主要由LKB1/AMPk/mTOR、PI3K/AKT/mTOR 和氨基酸通路这3 条信号通路调节[11～13]。

本实验运用免疫组织化学方法研究p-mTOR 在结直肠腺癌粘膜组织及癌旁正常组织中的表达情况，结果显示，mTOR 蛋白在结直肠腺癌粘膜组织中表达的阳性率为56.67%，明显高于癌旁正常粘膜组织的22.5%，二者之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示mTOR 的过表达与结直肠腺癌的发生有密切的联系。mTOR 信号通路作为细胞内重要的调节枢纽，与结直肠癌的形成和进展有紧密的联系[11]。Slattery等人[14]将1574例患结肠癌病例与1940例对照组进行病例对照分析，结果示mTOR 蛋白的过度表达与结肠癌的发生呈现显著相关（OR=1.21，95% CI 为1.05～1.38）。王茜等[15]分析mTOR 蛋白在63例结直肠癌组织、27例转移淋巴结组织、12例转移癌组织中的表达情况，得出结论p-mTOR 在结直肠癌及转移癌组织中过表达可以作为结直肠癌病理分期及预后的重要指标，且肿瘤组织中mTOR 蛋白表达阳性患者的PFS 及OS 均显著低于肿瘤组织中mTOR 蛋白表达阴性的患者。赵长林等[16]探讨分析60例直肠癌、30例直肠腺瘤、10例正常直肠粘膜组织中p-mTOR 表达情况，认为mTOR 蛋白高表达在直肠癌侵袭转移中可能发挥重要作用。以上研究证实mTOR 蛋白高表达与结直肠癌的发生发展紧密相关，甚至影响肿瘤细胞的浸润与转移。这也为mTOR 信号通路作为结直肠癌药物治疗靶点提供了更多的证据。

此外，本实验分析p-mTOR 表达情况与结直肠腺癌患者临床病理资料之间的关系表明：p-mTOR 的表达与患者年龄、性别、肿物大小、肿瘤部位、浸润深度无明显相关性（P＞0.05）；而与患者淋巴结转移、TNM分期、分化程度有关（P＜0.05）。张毅等人[17]的研究也表明p-mTOR 的表达与直肠癌病人术前的CEA 水平、分化程度、TNM 分期、淋巴结转移和远处转移等情况有关，差异有统计学意义。本次实验结果示：p-mTOR在结直肠腺癌粘膜组织中阳性表达明显高于癌旁组织，且与患者淋巴结转移、TNM 分期、分化程度有关，差异有统计学意义，因此p-mTOR 可能作为结直肠腺癌发病、转移及评价肿瘤恶性程度的潜在参考指标。

本实验通过免疫组织化学法检测p-4EBP1 在结直肠腺癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，结果显示：其在结直肠腺癌粘膜组织中表达的阳性率为48.33%，高于癌旁正常组织的27.50%，两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。张毅等人[17]的研究结论为：p-4EBP1 在直肠癌组织及癌旁组织中的表达阳性率分别为79.00%和22.50%，二者之间差异具有统计学意义，与本结论一致。但p-4EBP1 的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移、TNM 分期、分化程度等未见相关，其差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示p-4EBP1 的表达情况尚不能作为提示结直肠癌转移浸润的可靠指标，还需大量实验进一步证实。

本实验通过免疫组织化学法检测p-S6K1 在结直肠腺癌组织及癌旁组织中的表达情况，结果显示：p-S6K1 在结直肠腺癌粘膜组织中表达的阳性率为56.67%明显高于癌旁正常组织的35.00%，两者之间差异有统计学意义（P＜0.05）。其在分化程度越低的肿瘤组织中表达越高，差异具有统计学意义，这也与文献报道的结果相一致[18,19]；且在肿瘤分期越晚的组织中表达越高，差异具有统计学意义，提示p-S6K1 不仅可为肿瘤的诊断提供依据，还可指示肿瘤的恶性程度及进展情况。但p-S6K1 的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度及有无淋巴结转移未见相关性，差异不具有统计学意义（P＞0.05），其能否作为结直肠癌浸润转移的参考指标尚缺乏可靠的理论依据。

本实验组间相关性分析结果显示：p-mTOR 与p-4EBP1 在结直肠腺癌粘膜组织中的表达具有一定的正相关趋势（r=0.268，P=0.038），提示二者在结直肠腺癌发生发展过程中可能存在一定的协同作用。pmTOR 与p-S6K1 在结直肠腺癌粘膜组织中的表达具有显著的正相关性（r=0.433，P=0.001），提示二者可能在结直肠腺癌发生及分化程度上有重要的协同作用。p-4EBP1 和p-S6K1 在结直肠腺癌粘膜组织中的表达无相关性（r=0.105，P=0.423），亦未见明显的相关趋势，二者在结直肠腺癌发展过程中的相互关系还需大量数据进一步探究。p-mTOR、p-4EBP1 和p-S6K1 三者的联合检测可能为结直肠腺癌的诊断及恶性程度评估提供一定的指向性[20]。