中药复方益糖康对db/db小鼠认知障碍的改善及铁死亡的作用＊

安继仁，刘天宇，石 岩，杨宇峰

（辽宁中医药大学第一临床学院 沈阳 110847）

1 引言

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是人类最常见的严重代谢性疾病，其特征是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗或二者兼有导致血糖异常[1]。近年来，DM引起的相关认知障碍成为研究的热点。流行病学调查显示，2型糖尿病（T2DM）患者的认知障碍发生率高于非糖尿病患者[2]。另有研究发现，T2DM与阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）有相似的病理改变，而海马则是T2DM早期脑干结构改变的主要区域之一[3]。因此，深入研究糖尿病认知障碍（Diabetic cognitive impairment，DCI）的发生机制和治疗方法尤为重要。

近年来大量研究表明，铁死亡在多种慢性疾病中起到重要作用。铁死亡是由于谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4，GPX 4）失活，细胞对半胱氨酸的摄取匮乏，导致谷胱甘肽（Glutathione，GSH）合成不足，抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白system Xc-（SLC7A11）,造成细胞膜脂质氧化分解[4-5]和线粒体结构破坏。研究发现，铁死亡与众多退行性病变的病理进展有关[6]，而在糖尿病肾病中也被证明具有重要作用[7]。然而，铁死亡在2型糖尿病认知障碍中的作用罕见报道，探究铁死亡在2型糖尿病认知障碍中的作用具有重要意义。

糖尿病属中医“消渴”范畴。糖尿病认知功能障碍主要因阴虚燥热，耗气伤阴，精不化血，阴血不足渐致血瘀停于脑络，呆病渐生[8-9]。石岩教授认为“脾虚”为糖尿病的病因病机特点，并以健脾益气养阴，活血化瘀为治疗原则，总结创制中药复方益糖康。该方由黄芪、黄精、白术、三七等12味药组成，具有健脾益气养阴、活血化瘀之功，标本兼顾，攻守兼施，被证明能够有效控制T2DM以及延缓并发症的发生[10]。因此，本研究通过db/db小鼠模型模拟2型糖尿病认知障碍损伤过程，观察中药复方益糖康对2型糖尿病认知障碍的改善作用，同时探讨本方是否通过对铁死亡相关通路调控发挥神经保护作用，以期进一步阐明2型糖尿病认知障碍的机制，为中药复方益糖康的临床应用提供一定理论依据。

2 材料与方法

2.1 动物及分组

SPF级雄性、9周龄的C57BL/6J db/db（以下简称db/db）小鼠24只随机分为3组：模型组（db/db组）、益糖康组（YTK组）以及西药（选用利拉鲁肽Liraglutide）对照组（LIRA组），另选择同笼杂合db/m小鼠8只作为正常对照组（db/m组）。动物购买自常州卡文斯实验动物有限公司，动物使用编号：SCXK（苏）2016-0010。

2.2 造模方法及给药

中药复方益糖康由红参、黄芪、黄精、甘草、白术、丹参、枸杞、葛根、三七、茯苓、五味子、黄连等12味药组成。小鼠适应性喂养一周后，YTK组小鼠予以益糖康煎剂灌胃30g/kg/天，中药饮片购买自辽宁中医药大学附属医院。利拉鲁肽（CSN11311,CSNpharm）皮下注射200µg/kg/天。给药时间共计5周。db/m组和db/db组给予蒸馏水灌胃5周。

2.3 样本采集

在造模第5周进行水迷宫实验检测，取材前一日进行旷场实验检测。行为学检测结束后第二天进行动物取材和组织分离，取材前12 h对小鼠禁食。配置1%戊巴比妥钠溶液，各组小鼠以50 mg·kg-1剂量麻醉后，于冰上迅速剥离全脑，其中4只直接固定于4%的多聚甲醛固定液（G1101，Servicebio）用于组织切片样本，其余4只分离海马组织后，切出1 mm×1 mm×1 mm组织浸泡于电镜固定液（G1102，Servicebio）中用于电镜切片观察，剩余海马分装于灭菌EP管并置于液氮速冻，后捞出放于-80℃冰箱备用。

2.4 指标检测方法

2.4.1 小鼠空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数测定

使用血糖试纸（S59400839789,Sannuo）检测小鼠取材前的空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）值。取材时，采用一次性注射器心脏取血，1500 r·min-1，离心15 min，取上清液，采用ELISA试剂盒（EIA-2358，ELISA-Biotech）对空腹血清胰岛素（Fasting serum insulin，FINS）测定。同时，计算胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）。HOMA-IR的计算按照公式为：HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

2.4.2 水迷宫测试

Morris水迷宫试验用于测试小鼠空间记忆能力和学习能力。实验结束前一周进行水迷宫实验。实验第1天，将平台置于水面（可视平台）上方进行记忆训练。第2天至第6天，将平台放置在水面以下（隐蔽平台）进行逃逸实验。将每只老鼠从四个不同的方向中的一个放置在水槽中，记录它们的移动距离和到达平台的潜伏期。第7天，进行撤平台穿越实验，记录2 min内小鼠穿过平台位置的次数。

2.4.3 旷场实验测试

旷场实验用于确定小鼠的自主行为是否正常与是否产生焦虑状态。实验结束前一天进行旷场实验。将小鼠放置在区域大小为长50 cm×宽50 cm×高40 cm的箱内，上方安置摄像头进行轨迹记录，中间为中心区域，其他为边缘区域。将小鼠面朝墙放入边缘区域放入后适应1 min，之后让其自由探索环境5 min。每只小鼠测试结束后，用湿布洗擦场地并用干布擦干。全部小鼠测试结束后，分析中心区域停留时间及路程，算出小鼠停留中心区域时间占总时间的百分比。

2.4.4 石蜡包埋制备和切片

石蜡包埋：脑组织用固定液固定48h后，将组织从固定液取出并将海马部位组织切出并修整平；将修切好的组织放于脱水盒中，放置于脱水机内依次按照75% 4 h、85% 2 h、90% 2 h、95% 1 h、100% I 30 min、100% II 30 min进行梯度酒精脱水，之后醇苯5-10 min，二甲苯I/II各5-10 min，同时在60℃的融化石蜡Ⅰ/Ⅱ中各2 h；将融化的蜡倒入包埋框，并将浸好蜡的组织从脱水盒内取出放入包埋框放入蜡中，在-20°冷冻台上冷却，凝固后取出备用。

切片：将蜡块放入-20℃冷冻台上冷却，之后置于全自动轮转式切片机（RM2255，Leica）切片，切片厚4µm。切片漂浮于摊片机（KD-P，科迪仪器设备有限公司）在40℃水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，放入60℃烘箱内烘干后取出备用。

2.4.5 尼氏染色

切片进行脱蜡、复水，放入甲苯胺蓝染液（G1032，Servicebio）染色2-5 min，之后水洗去染色液，用0.1%的冰醋酸分化10s，后自来水洗终止；放入无水乙醇迅速脱水，后用二甲苯透明10 min，中性树胶封片。树脂凝固后，显微镜（DM3000，Leica）观察并采集。Image J定量分析Nissl小体数量。

2.4.6 透射电镜检测

将电镜固定液中的海马组织取出，0.1M PBS（PH7.4）漂洗3次，每次15 min；之后使用0.1M PBS配制的1%锇酸（Ted Pella Inc）避光室温固定2 h，之后PBS漂洗3次，每次15 min；后固定结束后，将组织依次放入30%、50%、75%、85%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精脱水，每次20 min，然后100%丙酮两次，每次15 min；将纯812包埋剂（90529-77-4，SPI）倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜进行包埋；包埋后，将包埋板放于60℃烤箱聚合48 h，取出树脂块，放置于超薄切片机切片，厚度60-80 nm，150目方华膜铜网捞片；铜网于2%醋酸铀饱和酒精溶液中避光染色8 min，之后70%酒精清洗3次，超纯水清洗3次；用2.6%的枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min，之后超纯水清洗3次，滤纸稍吸干，铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。透射电子显微镜（HT7800，Hitachi）下观察并采集图像。

2.4.7 免疫荧光检测

切片进行脱蜡、复水，PBS清洗3次；加入0.01 mol枸椽酸缓冲液（pH=6.0）在98℃下进行抗原修复，恢复至常温后用山羊血清孵育1 h，孵育后PBS清洗3次；之后吸干血清，加入一抗Cox1（DF8920，Affinity）、Cox4（A10098，Abclonal）、Nrf 2（GB11962，Servicebio）和GPX 4（ER1803-15，Huabio），4℃过夜，PBS清洗3次；滴加荧光二抗，37℃孵育60 min，PBS清洗3次；滴加DAPI液反应3 min，PBS清洗3次；滴加抗荧光衰减封片剂封片。显微镜（DM3000，Leica）观察并采集图像。Image J定量分析阳性区域面积。

2.4.8 Western blot检测

Western blot检测小鼠海马内蛋白表达。首先，RIPA裂解液裂解海马组织。离心后，收集上清液，并用BCA蛋白质测定试剂盒（CW0014S，Cwbiotech）测定蛋白浓度。将10µg蛋白添加到聚丙烯酰胺凝胶中并按分子量分离。将分离的蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭，孵 育 一抗GPX 4（ER1803-15，Huabio）、SLC7A11（ARG57998，Arigo Biologicals）、PSD 95（GB11277，Servicebio）、SYN（17785-1-AP，Proteintech）、BDNF（GB11559，Servicebio）和Nrf 2（GB11962，Servicebio），4°C过夜。用TBST洗涤3次后，用HRP结合的二抗孵育，用多功能成像系统（Vilber Fusion FX5 spectrum）通过化学发光显示条带。用Image J定量分析蛋白条带的光密度。

2.4.9 统计学分析

3 结果

3.1 中药复方益糖康对血糖异常、胰岛素异常和胰岛素抵抗指数的改善

如表1，与db/m组相比，db/db组FBG值明显升高（P＜0.01），而LIRA组与YTK组血糖明显下降（P＜0.01）。ELISA检测结果显示，db/db小鼠FINS明显升高（P＜0.01），而LIRA组和YTK组FINS有明显改善（P＜0.01，P＜0.05）。同时，HOMA-RI计算结果表明，与db/m组比较，db/db组值明显升高（P＜0.01），而给予LIRA和YTK后显著性降低（P＜0.01）。

表1 各组小鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数变化

3.2 中药复方益糖康对水迷宫实验结果的影响

如图1，与db/m组比较，db/db小鼠第2-6天水迷宫实验中逃逸路程和逃逸潜伏时间显著增加（P＜0.05），而LIRA组与YTK组小鼠逃逸时间和逃逸路程均下降（P＜0.05）。第7天穿越平台结果显示，db/db小 鼠2 min内穿越平台次数明显减少（P＜0.01），而LIRA组 和YTK组 小 鼠 穿 越 平 台 次 数 回 升（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组小鼠水迷宫实验结果

3.3 中药复方益糖康对旷场实验结果的影响

如图2，旷场迷宫结果发现，db/db小鼠在中心区域活动路程以及所占总时长时间百分比均减少（P＜0.05），而YTK可以改善db/db小鼠的中心区域路程比及时间比（P＜0.05），但LIRA治疗的改善无明显统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组小鼠旷场实验结果

3.3 中药复方益糖康对神经元的作用

如图3，Nissl染色结果表明，与db/m组相比db/db小鼠海马CA1、CA3区以及齿状回（Dentate gyrus，DG）的染色变浅，同时海马不同区域的Nissl小体数量下降（P＜0.001），形态萎缩，而给予LIRA及YTK后Nissl小体数量均明显增加（P＜0.001），形态改善。

图3 尼氏染色观察db/db小鼠神经元的影响

3.4 中药复方益糖康对突触可塑性的作用

如图4，western blot结果表明，db/db小鼠海马中突触后致密物质95（Postsynaptic density 95，PSD 95）、突触素（Synaptophysin，SYN）和脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达被明显抑制（P＜0.05），给与LIRA和YTK后三种突触相关蛋白表达均有提升（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

图4 各组小鼠海马PSD-95、SYN与BDNF表达量比较

3.5 中药复方益糖康对神经元线粒体结构的影响

如图5，透射电镜结果显示，db/db小鼠海马神经元细胞的线粒体萎缩、线粒体脊减少，而LIRA组和YTK组小鼠海马神经元线粒体结构趋于正常。

图5 透射电镜观察db/db小鼠海马线粒体超微结构

3.6 中药复方益糖康对神经元线粒体功能的影响

如图6，免疫荧光双标检测小鼠海马Cox1、Cox4表达。结果显示，与正常组相比，db/db组小鼠Cox1荧光强度减弱（P＜0.001），Cox4荧光表达增加（P＜0.01）。与db/db组比较，LIRA组和YTK组Cox1表达上升（P＜0.001），而Cox4表达下调（P＜0.05）。

图6 免疫荧光检测db/db小鼠海马Cox1与Cox4表达

3.7 中药复方益糖康对铁死亡的影响

如图7所示，免疫荧光结果表明，db/db组小鼠GPX 4和Nrf 2表达下降（P＜0.001，P＜0.05），而LIRA组和YTK组GPX 4的表达回升（P＜0.01，P＜0.001），YTK组Nrf 2表达明显升高（P＜0.05），但LIRA组Nrf 2变化无统计学意义（P＞0.05）；

图7 免疫荧光检测db/db小鼠海马Nrf 2与GPX 4表达

如图8所示，western blot结果表明，db/db组小鼠GPX 4、SLC7A11及Nrf 2蛋白表达下降（P＜0.05），而YTK组的GPX 4、SLC7A11及Nrf 2蛋白表达均得到上调（P＜0.05），LIRA组GPX 4、SLC7A11蛋白表达升高（P＜0.05），Nrf 2蛋白表达无明显统计学意义（P＞0.05）。

图8 各组小鼠海马GPX 4、SLC7A11和Nrf 2表达量比较

4 讨论

全球糖尿病患病率、发病率和糖尿病患者数量急剧上升。据《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》报道，中国成人DM患病率从1980年0.67%飙升到2013年11.2%且继续呈上升态势，其中T2DM患者占90%以上，居全球首位[11]。大量研究证实，与普通人群相比，糖尿病患者患认知障碍的风险更高[12]，而全世界1/10到1/15的痴呆发病率可归因于T2DM[13]。虽然目前临床上可以有效地控制血糖，但DCI的发生发展并未完全阻断，具体机制仍不清楚，因此需要进一步研究。LIRA对认知障碍以及许多神经退行性疾病的优异作用已广泛证实[14,15]，被明确可降低与氧化应激，炎症和记忆丧失相关的神经系统疾病的风险[16]，这与其他降糖药物相比具有更大的优势，因此本研究选择其作为阳性对照药物。我们的前期研究表明，益糖康可以有效改善STZ大鼠FBG，FINS、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三脂水平，调节糖脂代谢异常[17]，本次研究在db/db模型小鼠上进一步验证了其调控糖代谢和胰岛素分泌的稳定性。

记忆缺陷和自主行为异常是T2DM引起海马损伤的两个重要表现。前期研究证实，db/db小鼠在10周龄时即可表现出明显的认知能力受损[18]。水迷宫的结果表明db/db小鼠的长时程记忆和空间记忆功能受损，探索能力不足，益糖康可以有效地改善认知的损伤。同时大量证据表明，抑郁和焦虑等情绪障碍在T2DM中非常普遍[19]，db/db小鼠也被证明具有精神异常症状和焦虑行为[20]。旷场实验是反映小鼠自主行为和焦虑样表现的一种行为学检测方法。其结果表明，益糖康可以有效改善db/db小鼠的焦虑样表现，是相较LIRA体现出的独特的优势，这或许是中药对患者中枢调节的特殊优势。作为认知表现的重要因素，神经元和突触可塑性在反映学习记忆能力方面起着重要作用[21]。实验结果表明，db/db小鼠的Nissl染色表现出明显的神经元丢失。此外，突触相关蛋白的表达验证了突触的损伤。SYN是一种神经元中重要的突触小泡蛋白，是参与细胞膜结构和其他成分组成的重要物质[22]。研究发现，SIAH-1能在高糖低氧条件下下调SYN的表达[23]，参与了短期和长期突触可塑性的调节[24]。我们的结果显示db/db组小鼠SYN表达下调，这可能是导致认知障碍的原因之一。PSD 95是重要的神经元骨架蛋白，参与突触的成熟、稳定性、传递和大脑记忆形成[25]。之前研究发现，STZ诱导的T2DM大鼠脑内PSD 95蛋白水平降低，而药物干预后PSD 95的表达可以改善[26]。BDNF是神经营养因子家族的主要成员，在长时程记忆增强和神经可塑性中至关重要[27]。我们的结果发现，益糖康明显上调了突触相关蛋白的表达，降低神经元丢失，可能是db/db小鼠认知障碍改善的重要因素。

我们的结果证实，中药复方可以明显改善db/db小鼠海马内出现的铁死亡。铁死亡的生物学特征为铁和脂质过氧化物的聚集。超微结构显示，铁死亡时线粒体萎缩、线粒体脊减少甚至消失、膜密度增加，线粒体结构得到明显的破坏。本研究发现益糖康可以有效地保护海马细胞线粒体结构，这对神经元线粒体的稳定有着重要意义。作为有氧呼吸的主要场所，线粒体复合物的合成从合成线粒体编码的Cox1开始，Cox1作为构建复合物的基石[28]。Cox4同样与线粒体呼吸功能密切相关。当出现损伤时，Cox4可代偿性上调[29]。我们的结果表明益糖康可以明显改善db/db小鼠中下调的Cox1和上调的Cox4，进而恢复线粒体功能。

有报道将铁死亡与脑损伤联系起来，确立了两者相关性[31]。而最新报道称，铁死亡与1型糖尿病认知功能障碍有关，SLC40A1介导了铁死亡[32]。核因子E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf 2）是细胞抗氧化反应的关键调节因子，在维持氧化还原稳态方面的作用已得到充分证实，同时已被证明在糖脂代谢、铁/血红素代谢等其他关键代谢途径中发挥关键作用[33]。研究发现，Nrf 2可以调控SLC7A11和GPX 4的表达从而抑制铁死亡，而铁的调控亦可由Nrf 2靶基因介导[34]。动物实验证明铁死亡参与了糖尿病肾病的发展，并通过上调Nrf 2抑制了糖尿病诱导铁死亡，延缓了糖尿病肾病的进展[35]。我们的实验结果表明，益糖康可以通过上调db/db小鼠海马中的GPX 4、SLC7A11，抑制海马的铁死亡，这可能与Nrf 2蛋白的调控相关。课题组今后将在细胞层面通过铁死亡激动剂和抑制剂进一步探究上游相关的机制，同时深入探究铁代谢在糖尿病认知障碍中的具体调控和益糖康的作用，以更深入证明T2DM认知障碍中铁死亡的作用和中药复方益糖康的优势。

5 结论

益糖康可有效缓解db/db小鼠认知障碍，其作用机制可能是通过上调Nrf 2的表达提高SLC7A11和GPX 4表达，从而抑制铁死亡，进一步对神经元和突触可塑性产生保护作用，最终改善小鼠的认知功能。