上调miR-138-5p对舌鳞状细胞癌细胞增殖及上皮间质转化的影响

杨晋，张娟，高杰，马素伟，王焱，靳昊

（保定市第二中心医院口腔科，河北 保定 072750）

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，转移性和复发率高，预后差[1]。化疗、放疗和手术治疗均会产生一定的副作用，因此寻找新的治疗TSCC的靶向分子指标已成为当下研究的热点。微小RNA（microRNA,miRNA）可通过靶向调控其目的基因的表达，影响多种细胞功能。其中，miR-138-5p可通过直接靶向RHBDD1基因抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）[2]，通过靶向ZEB2基因抑制肺腺癌细胞EMT、生长和转移[3]，且miR-138在口腔鳞状细胞癌中下调[4]。而组蛋白甲基化转移酶（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）是细胞增殖、细胞周期、癌细胞转移、肿瘤发生等多种生物进程的表观遗传调控因子[5]，敲低EZH2表达可抑制TSCC细胞侵袭迁移能力[6]。但是，目前miR-138-5p和EZH2在TSCC中的相互作用机制尚未见报道，因此，本研究通过上调miR-138-5p表达，观察其对TSCC细胞Tca-8113增殖、凋亡、EMT进程及EZH2蛋白表达的影响，并探讨其潜在的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株

永生化的舌上皮株Hacta细胞和舌鳞癌细胞株Tca-8113均购自中国科学院典型培养物保存委员会细胞库。

1.2 主要试剂及仪器

野生型和突变型EZH2 3'UTR荧光素酶报告基因载体（EZH2 WT、EZH2 MUT）；miR-138-5p NC（miR-138-5p阴性对照）、miR-138-5p模拟物（miR-138-5p mimics）、si-EZH2（EZH2小干扰RNA）、si-NC（EZH2小干扰RNA阴性对照）、pcDNA NC（过表达EZH2阴性对照质粒）、pcDNA EZH2（过表达EZH2重组质粒）以及miR-138-5p、EZH2、U6和β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；β-联蛋白（β-catenin）、上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）鼠抗和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗均购自美国Abcam公司；尼康SMZ745光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式细胞仪购自美国Beckman公司；全能型凝胶成像分析系统ChemiDoc-MP购自山东三瑞科技有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养与分组

Hacta和Tca-8113细胞使用含10%（φ）胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃，5%（φ）CO2培养箱中培养。

本研究共分为以下几组：Hacta组（永生化的舌上皮细胞株）、Tca-8113组（未转染Tca-8113细胞）、miR-138-5p NC组（Tca-8113细胞转染miR-138-5p NC）、miR-138-5p mimics组（Tca-8113细 胞 转 染miR-138-5p mimics）、si-NC组（Tca-8113细 胞转si-NC）、si-EZH2组（Tca-8113细胞转染si-EZH2）、miR-138-5p mimics+pcDNA NC组（Tca-8113细胞共转染转miR-138-5p mimics和pcDNA NC）、miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2组（Tca-8113细胞共转染miR-138-5p mimics和pcDNA EZH2）；取生长密度 达50%～60%的Tca-8113细 胞，使 用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染后，培养24 h。

2.2 qRT-PCR检测细胞中miR-138-5p和EZH2 mRNA表达水平

采用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，逆转录试剂盒得到cDNA，以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系：2×SYBR mix 10 μL，H2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，10×cDNA模板1 μL。反应条件设定为：95℃预变性5 min、95℃变性15 s、60℃退火50 s、40个循环、72℃延伸10 min。分别以β-actin、U6作为内参，根据2-ΔΔCt算法，计算EZH2 mRNA、miR-138-5p表达水平。miR-138-5p、EZH2、U6及β-actin引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

2.3 生物信息学预测和双荧光素酶验证miR-138-5p和EZH2的靶向关系

采 用TargetScan在 线 网 站（http：//www.targetscan.org/mmu_72/）对miR-138-5p作用的靶基因进行预测，发现EZH2为其可能的靶分子。取对数生长期的Tca-8113细胞接种于96孔板，常规培养24 h后，将细胞分为miR-138-5p mimics+EZH2 WT组、miR-138-5p NC+EZH2 WT组、miR-138-5p mimics+EZH2 MUT组和miR-138-5p NC+EZH2 MUT组，每组设6个复孔，使用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行细胞共转染。转染48 h后，使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，验证miR-138-5p与EZH2的靶向关系。

2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性

收集培养24 h后各组细胞，每组设置6个复孔，以8×103/mL接种至96孔板，各加10 μL CCK-8溶液避光孵育2 h，采用酶标仪检测各孔450 nm处吸光度（A）值。A值越大表明其增殖活性越高。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集培养24 h后各组细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次后，加入400 μL结合缓冲液悬浮细胞，再加入5 μL Annexin V染液，轻轻混匀后置于2～8℃避光条件下孵育15 min；然后加入10 μL PI轻轻混匀，于2～8℃避光下继续孵育5 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.6 Transwell小室法检测各组细胞迁移和侵袭能力

迁移能力检测：取各组细胞，用不含FBS的DMEM/F12培养基，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×108个/mL，按照Transwell小室试剂盒说明书进行操作，光学显微镜下观察并计数穿过微孔膜的细胞。侵袭能力检测：取Matrigel胶铺于Transwell小室的上室，其余步骤同细胞迁移能力检测实验。

2.7 Western blot检测各组细胞EMT相关蛋白βcatenin、E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平

收集培养24 h后各组细胞，提取总蛋白，对蛋白进行定量。然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭1 h、1∶2 000浓度稀释后的β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH鼠抗4℃过夜孵育、含辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，用ECL显色试剂盒显色，全能型凝胶成像分析系统拍照，以GAPDH为内参，分析各组蛋白表达水平。

2.8 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用snk-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Hacta和Tca-8113细胞中miR-138-5p、EZH2表达水平比较

与Hacta组相比，Tca-8113组细胞miR-138-5p表达水平显著降低，EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。见图1。

图1 Hacta和Tca-8113细胞中miR-138-5p、EZH2 mRNA和蛋白表达水平Figure 1 Expression of miR-138-5p,EZH2 mRNA and protein in Hacta and Tca-8113 cells

3.2 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞EZH2 mRNA和蛋白表达的影响

与Tca-8113组和miR-138-5p NC组相比，miR-138-5p mimics组Tca-8113细胞miR-138-5p表达水平显著升高（P＜0.05），EZH2 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞miR-138-5p和EZH2表达水平的影响Figure 2 Effect of upregulation of miR-138-5p on miR-138-5p and EZH2 expression in Tca-8113 cells

3.3 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞增殖、凋亡的影响

与Tca-8113组和miR-138-5p NC组相比，miR-138-5p mimics组Tca-8113细胞增殖活性显著降低（P＜0.05），凋亡率显著升高（P＜0.05）。见图3。

图3 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞增殖、凋亡的影响Figure 3 Effect of upregulation of miR-138-5p on proliferation and apoptosis of Tca-8113 cells

3.4 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞侵袭迁移能力的影响

与Tca-8113组和miR-138-5p NC组相比，miR-138-5p mimics组Tca-8113细胞迁移和侵袭能力显著降低（P＜0.05）。见图4。

图4 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞侵袭迁移能力的影响Figure 4 Effect of upregulation of miR-138-5p on invasion and migration of Tca-8113 cells

3.5 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞EMT进程的影响

与Tca-8113组和miR-138-5p NC组相比，miR-138-5p mimics组Tca-8113细胞β-catenin和E-cadherin表达水平显著升高（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表达水平显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 上调miR-138-5p对Tca-8113细胞EMT相关蛋白表达水平的影响Figure 5 Effect of upregulation of miR-138-5p on EMT related protein expression in Tca-8113 cells

3.6 miR-138-5p和EZH2的靶向关系

生物信息学预测结果显示，miR-138-5p序列上存在与EZH2 3'UTR结合的连续位点。与miR-138-5p NC+EZH2 WT组 相 比，miR-138-5p mimics+EZH2 WT组荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而miR-138-5p mimics+EZH2 MUT组和miR-138-5p NC+EZH2 MUT组荧光素酶活性无明显变化。见图6-7。

图6 生物信息学预测miR-138-5p和EZH2 3'UTR结合位点Figure 6 Bioinformatics prediction of miR-138-5p and EZH2 3'UTR binding sites

3.7 干扰EZH2对Tca-8113细胞增殖和EMT的影响

与Tca-8113组和si-NC组相比，si-EZH2组Tca-8113细胞β-catenin和E-cadherin表达水平显著升高（P＜0.05），EZH2 mRNA表达水平增殖活性、N-cadherin和vimentin表达水平显著降低（P＜0.05）。见图8。

图8 干扰EZH2对Tca-8113细胞增殖活性和EMT相关蛋白表达的影响Figure 8 Effect of EZH2 interference on the proliferation activity and EMT-related protein expression of Tca-8113 cells

3.8 过表达EZH2逆转上调miR-138-5p对Tca-8113细胞凋亡、迁移和侵袭的影响

与miR-138-5p mimics组和miR-138-5p mimics+pcDNA NC组相比，miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2组细胞增殖活性、迁移和侵袭能力显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。见图9。

图7 双荧光素酶报告实验检测miR-138-5p和EZH2的靶向关系Figure 7 Targeting relationship between miR-138-5p and EZH2 detected by double luciferase reporter experiment

图9 过表达EZH2逆转上调miR-138-5p对Tca-8113细胞凋亡、迁移和侵袭的影响Figure 9 Overexpression of EZH2 reverses the effect of upregulation of miR-138-5p on apoptosis,migration and invasion of Tca-8113 cells

3.9 过表达EZH2逆转上调miR-138-5p对Tca-8113细胞EMT进程的影响

与miR-138-5p mimics组和miR-138-5p mimics+pcDNA NC组 相 比，miR-138-5p mimics+pcDNA EZH2组Tca-8113细 胞β-catenin和E-cadherin表达水平显著降低（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表达水平显著升高（P＜0.05）。见图10。

图10 过表达EZH2逆转上调miR-138-5p对Tca-8113细胞EMT相关蛋白表达的影响Figure 10 Overexpression of EZH2 reverses the effect of upregulation of miR-138-5p on the expression of EMT-related proteins in Tca-8113 cells

4 讨论

TSCC是一种常见的口腔癌，约占口腔癌的25%～40%，晚期TSCC患者多产生癌细胞局部浸润和淋巴结转移，且术后常出现复发[7]，所以探索新的生物标志物对TSCC早期的诊断治疗具有重要的临床意义。

本研究发现，与永生化的舌上皮细胞株Hacta相比，Tca-8113癌细胞miR-138-5p表达水平显著降低，EZH2 mRNA和蛋白表达水平升高，提示miR-138-5p在TSCC中 低 表 达，EZH2在TSCC中 高 表达。本研究进一步通过生物信息学预测及双荧光素酶实验验证发现，miR-138-5p和EZH2存在靶向关系。另有研究发现，miR-138-5p对肺癌[8]等癌细胞的增殖、迁移具有抑制作用，其中miR-138-5p可通过靶向调控TCF3基因抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭和迁移[9]，miR-138靶向AKT1参与舌鳞状细胞癌的迁移和侵袭[10]。本研究发现，上调miR-138-5p可提高Tca-8113细胞凋亡率及上皮标志蛋白β-catenin、E-cadherin表达水平，降低其增殖活性、侵袭迁移能力及间质标记蛋白N-cadherin、vimentin表达水平，提示上调miR-138-5p可提高Tca-8113细胞凋亡率，降低其增殖活性和EMT的发生，且上调miR-138-5p表达也可显著提高Tca-8113细胞EZH2 mRNA和蛋白表达水平。而EZH2通常在人类癌症组织中上调，Jia等[11]研究发现沉默EZH2可抑制TSCC的增殖和转移，Shih等[12]研究发现EZH2可作为TSCC发生的预测因子，促进TSCC转移。本研究亦发现，干扰EZH2可抑制Tca-8113增殖活性和EMT进程，而过表达EZH2可逆转上调miR-138-5p对Tca-8113细胞凋亡、迁移、侵袭和EMT进程的影响。Zhang等[13]研究发现抑制miR-138-5p可通过调控EZH2的表达，逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性，而下调miR-138-5p可通过激活EZH2，诱导前列腺癌细胞提高多西他赛耐药性[14]，均与本研究结果相似。提示miR-138-5p可通过靶向抑制EZH2蛋白表达，抑制Tca-8113细胞增殖、迁移侵袭及EMT进程，促进细胞凋亡。

综上所述，上调miR-138-5p可通过靶向抑制EZH2的表达，促进TSCC细胞Tca-8113凋亡，降低其增殖、侵袭迁移能力和EMT进程，有望为TSCC的临床研究提供潜在可行的靶点。但是miR-138-5p靶基因较多，miR-138-5p也可能通过调控其他因子或信号通路，影响TSCC细胞生物学行为，这有待后续深入研究。