重组禽流感疫苗免疫抗体检测操作方法及注意事项

黄 新 平和县动物疫病预防控制中心 福建 平和 363700

高致病性禽流感是一种由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类感染为主、人畜共患的一类动物疫病。我国长期将高致病性禽流感列入强制免疫重要疫病之一，乡镇、村级禽散养户、禽规模养殖场要常年对禽类强制免疫疫苗，县级动物疫病预防控制中心实验室需定期对禽类进行常规监测。2022年，福建省采用重组禽流感三价灭活疫苗对家禽进行免疫，现就血清学抗体检测具体操作方法及结果介绍如下。

1 样品准备

1.1 样品采集 平和县霞寨镇高寨村卢某鸡养殖场存栏90日龄鸡2 530羽，分别于2022年3月20日、4月11日用吉林冠界生物技术有限公司生产的重组禽流感（H5＋H7）三价灭活疫苗二次免疫注射。用一次性注射器采集该养殖场40头份鸡全血，每份1 mL左右；采好血样的注射器要留有空气，斜放在有冰袋的采样箱内。

1.2 样品处理 样品应及时处理，将注射器内的血全部注射到1.5～2 mL离心管内；用记号笔按1～40做好编号标注；打开离心机，将样品对称放置，5 000 r/min常温下离心5 min。

2 血凝(HA)试验与血凝抑制（HI）试验

2.1 材料准备96孔V型一次性反应板19个；5～50 uL单 道 移 液 枪1把，10～100 uL多 道 移 液 枪1把；pH7.2、0.01 mol/L PBS溶液；哈尔滨国生生物有限公司生产的高致病性禽流感病毒H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re14株抗原及其阴性、阳性血清各1瓶。

1%鸡红细胞悬液制备。用含抗凝剂的一次性注射器抽取未免疫过禽流感疫苗的公鸡翅静脉血10 mL，摇匀，分别装入两支离心管中，对称放置在离心机上，依次在2 000 r/min、3 500 r/min、5 000 r/min离心，每次5 min，每次离心后吸弃离心管内血液上清液、分层中透明及无色部分，只留下红细胞。取红细胞0.5 mL，加入PBS溶液49.5 mL，制成50 mL1%鸡红细胞悬液。

2.2 血凝试验操作步骤

1）在96孔反应板第1～12孔上，用多道移液枪加入25 uLPBS溶液3排，换滴头。

2）多道移液枪装3个滴头，第一排、第二排、第三排的第1孔分别加入H5-Re13株抗原、H5-Re14株抗原、H7-Re14株抗原25 uL，混匀。

3）从每一排的第1孔吸25 uL到第2孔，混匀后再移25 uL到第3孔，如此依次稀释至第11孔，从第11孔吸25 uL弃之，换滴头。

4）每孔加入25 uL PBS，换滴头。

5）每孔再加入1%鸡红细胞悬液25 uL。

6）充分振荡，20～25℃室温下静置40 min后观察结果。

7）将反应板斜立，观察红细胞有无泪滴状流淌，不流淌的是完全血凝，最高稀释倍数代表1个血凝单位。经观察，第一排H5-Re13株抗原是10孔，第二排H5-Re14株抗原是9孔，第三排H7-Re14株抗原是10孔。

表1 样品HI效价测定结果

2.3 血凝抑制试验操作步骤

1）根据血凝试验结果，配制4 HAU病毒抗原，H5-Re13株的终点滴度为1:1 024，则4 HAU抗原的稀释倍数是1:256（1 024除以4）；H5-Re14株抗原的稀释倍数是1:128；H7-Re14株抗原的稀释倍数是1:256。

2）在18个反应板的第1～11孔用多道移液枪加入25 uL PBS，第12孔加入50 uL PBS，换滴头。

3）在第一板的第1孔加入禽流感阴性血清25 uL，混匀后吸25 uL至第2孔，依次稀释至第10孔，从第10孔吸取25 uL弃之，换滴头。

4）在第一板的第2孔加入禽流感阳性血清25 uL，混匀后吸25 uL至第2孔，依次稀释至第10孔，从第10孔吸取25 uL弃之，换滴头。

5）在第一板的第3孔加入25 uL样品血清，混匀后吸25 uL至第2孔，依次稀释至第10孔，从第10孔吸取25 uL弃之，直至40个样品全部对比稀释完成，每个样品换1个滴头。以上三步再重复两次。

6）在1～6反应板的1～11孔均加入含4 HAU混匀的H5-Re13株25 uL，换滴头；在7～12反应板的1～11孔均加入含4HAU混匀的H5-Re14株25 uL，换滴头；在13～18反 应板的1～11孔 均 加 入 含4 HAU混匀的H7-Re14株25 uL，换滴头；20～25℃室温下静置30 min。

7）每孔加入1%鸡红细胞悬液25 uL，混匀，静置40 min后观察结果。

3 试验判定与结果

阴性对照12孔全部呈钮扣状、沉到孔底，阳性对照孔1～10孔呈泪滴状流淌，该结果成立。测得40个样品中有1个呈阴性、39个呈阳性，抗体合格率达97.5%，样品的HI效价见表1。

4 问题及对策

在禽流感血清学抗体检测过程中，常出现的一些问题及对策如下。

1）在制备公鸡红细胞悬液时，刚开始离心时转速不能过快，防止红细胞破裂而溶血，第一次离心转速用2 000 r/min，第二次用3 500 r/min，第三次用5 000 r/min，每次离心5 min。

2）试验过程中使用的生理盐水，应采用0.9%氯化钠，浓度过高会引起红细胞凝固、抗原失效，造成试验失败。所以，每次试验前要检查是否使用生理盐水；加完红细胞后要进行振荡，使所加的样品与试剂、红细胞完全溶合。

3）使用移液枪时，每完成一个步骤要换滴头，每个样品要使用1个滴头。

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（本刊编辑部）