一例猪蓝耳病与猪圆环病毒病及多重细菌共感染的实验室诊断

黄喜荣 陈羽璇 张鑫杰 薛少华 吕紫欣 蒙 宁 戴爱玲,2,3＊

（1.龙岩学院生命科学学院 福建 龙岩 364000；2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心 福建 龙岩 364000；3.福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室 福建 龙岩 364000）

猪蓝耳病又称为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起猪繁殖障碍和呼吸系统的高度接触性传染病。可通过唾液、公猪精液、粪便、母猪垂直传播等方式传播，传播范围很广，极难防控。我国华北地区于1995年从加拿大进口的种猪中首次分离出该病毒[1]。猪圆环病毒（Porcine Circovirus，PCV）为目前发现的最小动物病毒之一，无囊膜，含共价闭合的单股环状负链DNA。目前已报道四种猪圆环病毒。猪圆环病毒1型无致病性，2型具有致病性，并且二者在猪群中广泛存在，3型、4型的致病性尚不确定[2]。2型是猪圆环病毒相关疾病 （Porcine circovirus associated disease，PCVAD）的主要病原体，极易感染哺乳期和保育期的猪而致病，一般不造成直接死亡，而是导致猪免疫力下降，耐过后终身带毒。断乳仔猪多系统衰竭综合征 （Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）是PCVAD的最常见形式，感染早期的PMWS猪群平均病死率为20%～40%，晚期PMWS感染最初发生在8～12周龄，主要临床症状是腹泻，一般与沙门氏菌共感染，其病死率高达80%[3-4]。在猪圆环病毒相关疾病中以断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）影响最为严重，给世界猪业带来巨大损失，同时在PMWS发生过程中猪繁殖与呼吸综合征病毒也起着非常重要的作用。猪蓝耳病和猪圆环病毒病都是免疫抑制病，能导致患猪对疫苗的免疫反应降低，进一步增加对其他传染病的易感性，使动物长期处于亚临床状态[5]。Rovira A等[6]通过共感染试验证明，PRRSV感染可促进PCV2的增殖，Harms P A等[7]发现PCV2能够加重PRRSV引起的支气管肺炎病理变化，这是引起二者共感染并造成巨大危害的主要原因。有研究对华东四个省份127份母猪繁殖障碍、仔猪呼吸困难的病料进行PCR检测，发现PRRSV与PCV2共感染病例占52.3%，表明二者有极高的共感染率[8]。

本研究对2021年福建省龙岩市某规模猪场发生的一例保育猪出现呼吸困难、咳嗽、消瘦等症状的病例进行综合诊断。该猪场存栏1 000头，其中母猪200头，2021年10月保育猪出现体温升高、精神低迷、呼吸困难、食欲不振、消瘦等临床症状，部分仔猪皮肤发绀，严重的腹式呼吸、腹泻、高热，个别仔猪死亡速度快，死前有四肢划动的神经症状，发病率达30%左右，病死率达60%以上。临床解剖发病保育仔猪，发现气管有大量脓性黏液，肺脏肿胀、肺脏表面有纤维素性渗出，心包炎，全身淋巴结肿胀，肺门淋巴结出血；肝脏、肾脏表面有少许出血点；膀胱、扁桃体、脾脏无明显临床眼观病变。该猪场猪瘟、猪伪狂犬病均按照正常的免疫程序进行免疫接种；蓝耳病采取一年统一免疫三次蓝耳病灭活疫苗、二次活疫苗（PC株）的免疫方式，仔猪不免疫；猪圆环病毒2型疫苗采取母猪不免疫，仔猪14～15日龄免疫基因工程疫苗（原核表达）的免疫方式；全场没有免疫相关细菌性疫苗。

1 材料与方法

1.1 样品来源与处理 对龙岩市某规模化猪场送检的3头患猪进行临床剖检，无菌采集发病猪的肝脏、肺脏深层组织，接种于含血清和NAD的TSA培养基，37℃恒温培养箱倒置培养24 h，观察菌落生长情况。

无菌采集患猪肝脏、肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏，按照剖检顺序进行编号，-80℃冻存、备用。

1.2 主要仪器ABI Veriti 96孔梯度PCR仪，购自ABI公司；MiniProTM EpBasic基础型电泳仪，购自翌圣生物科技有限公司。

1.3 主要试剂 病毒DNA/RNA共提取试剂盒，购自青岛英赛特有限公司；反转录试剂、2×Taq Master plus Mix、2×Phanta Flash Master Mix、胶回收试剂盒及DH5α，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DL 2000 DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；革兰氏染色试剂，购自北京陆桥技术有限公司；DH5α感受态细胞，购自上海唯地生物技术有限公司。

1.4 引物设计与合成 根据Genbank已公布的多个不同PCV2基因型序列设计用于PCV2检测的引物；根据标准[9]合成能够扩增PCV2基因组1 154 bp长度（序列分析）的引物对；根据PRRSV多个参考毒株设计用于PRRSV检测并能同时扩增ORF5全长的引物；细菌16S rRNA扩增引物参照文献进行合成[10]，CSFV和PRV检测用引物分别根据文献[11]和标准[12]合成，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。各引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 方法

1.5.1 病毒核酸提取 将采集的组织病料剪碎后置于2 mL EP管中，加入等体积灭菌PBS，置于组织研磨仪研磨，经反复冻融3次，离心取出上清，上清组织悬液立即用于核酸提取或置于-80℃保存。

参照病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书，提取样品DNA/RNA，DNA/RNA立即用于PCR反应或置于-80℃备用。

根据反转录试剂说明书对提取的样品RNA进行反转录，反转录获得的cDNA立即用于RT-PCR试验或置于-20℃备用。

1.5.2 PCR或RT-PCR检测 以提取的样品DNA为模板对PCV2、PRV进行PCR检测，PCR扩增体系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，样品DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PCV2及PRV检测的上下游引物各1 μL；PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，61℃/65℃（PCV2/PRV）退火30 s，72℃延伸45 s，共设置35个循环，72℃充分延伸5 min。

以反转录的cDNA为模板对PRRSV、CSFV进行RT-PCR检测，RT-PCR扩增体系25 μL：2×Taq Master plus Mix 12.5 μL，样品cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，PRRSV及CSFV检 测 的 上 下 游 引 物 各1 μL；RT-PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，53℃/55℃（PRRSV/CSFV）退 火30 s，72℃延伸50 s，共设置35个循环，72℃充分延伸5 min。PCR和RT-PCR扩增产物均用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5.3 目的片段的克隆及序列分析 使用高保真酶分别对PCV2、PRRSV及所分离细菌的16S rRNA进行扩增。以阳性样品DNA为模板对PCV2目的片段进 行PCR扩 增，PCR扩 增 体 系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，样 品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PCV2目的片段扩增上下游引物各2 μL；PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，62℃退火5 s，72℃延伸20 s，共设置35个循环，72℃充分延伸1 min。

以阳性样品cDNA为模板对PRRSV ORF5进行PCR检测，PCR扩增体系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，样品cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL，PRRSV目的片段扩增上下游引物各2 μL；PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，53℃退火5 s，72℃延伸20 s，共设置35个循环，72℃充分延伸1 min。

挑取24 h过夜培养的单菌落，应用水煮模板法提取细菌核酸。以提取的细菌核酸为模板对细菌16S rRNA进行PCR扩增，PCR扩增体系50 μL：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，样品DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，目的片段扩增上下游引物各2 μL；PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，61℃退火5 s，72℃延伸20 s，共设置35个循环，72℃充分延伸1 min。应用2%琼脂糖凝胶电泳试验对上述扩增产物进行鉴定。

根据胶回收试剂盒说明书对上述PCR产物进行纯化回收，将回收产物链接至pMD-19T载体，并转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落。将阳性菌落送至广东睿博兴科公司进行测序，测序结果用DNAstar软件的Megalin进行序列分析，并应用MEGA7软件的邻接法绘制遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 细菌分离鉴定 无菌采集发病猪的肝脏、肺脏深层组织进行细菌分离，结果显示，肉眼观察到血平板上出现三种形态不同的菌落，经革兰氏染色后1号和3号菌株为革兰氏阴性菌，2号菌为革兰氏阳性菌。

2.2 PCR或RT-PCR检测结果 对3份患猪组织样品的PRRSV和PCV2核酸进行检测。PRRSV检测结果显示，1号样品在750 bp左右出现目的条带（见图1a），2号、3号样品均未扩增出与预期大小一致的条带；PCV2检测结果显示，1～3号样品均在666 bp处有特异性条带（见图1b），均与预期结果相符。对样品CSFV、PRV核酸进行检测，结果显示3份样品CSFV、PRV病原核酸均为阴性。结果表明1号患猪检出了PRRSV和PCV-2病毒核酸，2号、3号患猪检出了PCV2病毒核酸。

图1 PRRSV、PCV2 PCR扩增结果

2.3 PCV2、PRRSV同源性序列分析与遗传进化分析

2.3.1 PRRSV序列分析 将测序所得1号样品毒株命名为ZGD-PRRSV，通过Genbank上所公布PRRSV参考毒株的ORF5基因序列进行序列比对发现，所获得ZGD-PRRSV ORF5序列长度为603 bp，为美洲型毒株。序列比对结果显示，ZGDPRRSV株与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、JAX1-p170、HuN4的相似性最高，为93.4%～94.0%；与参考毒株VR2332、CH1-a的核苷酸同源性为89.8%～89.9%；与NADC30、NADC34和QYYZ分支的毒株相似性较低，为81.7%～85.8%。 与参考毒株的遗传演化分析结果显示（见图2），ZGD-PRRSV毒株ORF5基因与HP-PRRSV代表毒株JXA1、HUN4、TJM-F92、CH-1R等处于同一分支，亲缘关系较近，为高致病性毒株；与国内目前主要流行的NADC30-like PRRSV代表毒株NADC30、CHsx1401、FJZ03具有一定的遗传距离，亲缘关系较远。

图2 PRRSV ORF5遗传进化分析

2.3.2 PCV2序列分析 应用DNAStar对1～3号样品PCV2测序结果进行鉴定，结果显示，1～3号样品PCV2核苷酸同源性为100%，均为同一毒株。将测序所得1～3号样品毒株命名为ZGD-PCV2，并与GenBank中登录的27株PCV2参考毒株进行序列比对及遗传进化分析，序列比对结果显示，与法国及西班牙参考毒株AY322004、GU049340.1的同源性最高，为96.1%～98.4%；与天津、广东、福建地区参考毒 株AY181946、AY682994.1、DQ180393的 同 源 性为92.7%～93.6%；与丹麦、江苏参考毒株EU148505、MG732801.1的同源性较低，为91.0%～92.7%。 遗传进化分析结果显示（见图3），ZGD-PCV2与法国及西班牙参考毒株AY322004、GU049340.1亲缘关系较近，同属于PCV2a亚型；与福建本地毒株DQ180393有较远的遗传距离，亲缘关系较远。

图3 PCV2遗传进化分析

2.4 细菌16S rRNA的PCR鉴定与测序 分别对所分离3个菌株的16S rRNA进行扩增，结果显示，1～3号菌株均在1 484 bp左右出现特异性条带（见图4）。对所获得3个菌株的16S rRNA进行克隆测序，BLAST快速比对结果显示，1号细菌与肺炎克雷伯菌16S rRNA的核苷酸同源性达99.9%以上；2号菌与猪链球菌16S rRNA的核苷酸同源性达99.9%以上；3号细菌与O157:H7血清型大肠杆菌（肠致病性）16S rRNA的核苷酸同源性达99.9%以上。

图4 16S rRNA的PCR鉴定结果

3 结论与讨论

根据临床症状、病理剖检、病原学检测，判定该猪场发病猪PRRSV、PCV2共感染，并发感染猪链球菌、肺炎克雷伯菌等，表明蓝耳病与圆环病毒病共感染且并发细菌病是该次疫情的主要原因；序列分析表明，感染的PRRSV为HP-PRRSV株，PCV2毒株为PCV2a亚型。

本试验检测的3份样品中，1份检出PRRSV与PCV2共感染，2份只检出PCV2感染，表明猪场圆环病毒感染比较严重。近年来，随着猪场规模化和集约化程度不断提高，猪场和猪群密度较大，病毒病或多种病毒共感染的发生率越来越大[8,11,13]。PRRSV与PCV2共感染在病毒性感染中危害最为严重，能够造成猪群的双重免疫抑制，抵抗力下降，从而易引起细菌继发感染[14]。在临床生产中，对猪蓝耳病和圆环病毒病的有效防控尤为重要。但由于PRRSV毒株具有遗传多样特征，现有蓝耳病弱毒疫苗免疫后不能提供有效的免疫保护，免疫后可抑制野毒复制，降低病毒血症水平和排毒，但不能阻止野毒感染，只能减轻临床症状。PRRS嵌合病毒活疫苗（PC株）和蓝耳病灭活疫苗联合免疫，虽然有报道在蓝耳病防控方面有一定的效果，但还需要在临床上持续跟踪[15-16]。对于该猪场病例，核苷酸同源性与遗传进化分析结果表明，该毒株与HP-PRRSV分支有较近的亲缘关系，因此，免疫同源性较高的高致病性蓝耳病疫苗株如JAX1-R株、HuN4-F112株等，可以提供更为有效的保护作用，减少经济损失。 猪圆环病毒病疫苗有全病毒灭活疫苗和亚单位基因工程疫苗，现有商品化疫苗主要以PCV2a毒株为基础[17]，该猪场感染的PCV2毒株为PCV2a基因型，虽然毒株同源性高，但疫苗使用效果除受生产工艺、毒株、病毒含量、佐剂、灭活剂影响外，还受免疫频次、机体健康等因素影响，有效的疫苗免疫才可以明显降低病毒血症，减轻临床发病症状[18]。猪链球菌、肺炎克雷伯菌、肠致病性大肠杆菌等在猪场是一种条件致病菌，常在猪体抵抗力下降时才表现发病症状。

调查发现，该猪场对母猪采取一年统一免疫三次蓝耳病灭活疫苗、二次活疫苗（PC株），仔猪未免疫蓝耳病疫苗；母猪未免疫猪圆环病毒病疫苗，仔猪14日龄免疫基因工程疫苗（原核表达）。虽然该猪场有接种疫苗，但缺乏后期相应的免疫监测，无法评估制定的免疫程序的合理性。此外，猪场受非洲猪瘟疫情影响，许多工作重心在生物安全措施管理方面，忽略了10月份是秋冬交替之际，南方山区昼夜温差大，断乳后保育猪的保温管理没有及时调整，导致保育猪在多重应激下发病。

针对该次疫情，猪场及时隔离患猪，淘汰无治疗价值患猪，对有治疗价值的猪选择肌注磺胺间甲氧嘧啶钠和头孢噻呋，群体添加抗生素如替米考星、阿莫西林和中药制剂如玉屏风颗粒和麻杏石甘颗粒，连用15 d（用量根据说明书）；同时加强生物安全防控和饲养管理，在保持栏舍通风保温前提下，减少昼夜温差，执行全进全出，保育舍至少空栏2周。建议猪场仔猪出生后用盐酸头孢噻呋做保健，预防断脐、剪牙、断尾、断乳过程中因伤口或应激引起细菌感染；建议近期怀孕母猪产前免疫2次猪圆环病毒病疫苗，以后全场一年免疫3～4次。1个月后对猪场进行回访，该猪场疫情得到有效改善，保育猪死亡率明显下降，说明该方案行之有效。