高毒力肺炎克雷伯菌实验室鉴定方法的研究进展

郑茂 袁成良 鄂建飞 邹玉

(1 德阳市人民医院检验科，德阳 618000；2 德阳市人民医院输血科，德阳 618000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是引起医院获得性感染和社区获得性感染的重要潜在病原体，也是近年来肠杆菌目中仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌。20世纪80年代，首次报道肺炎克雷伯菌的一个新变种，引发无胆道疾病的患者发生侵袭性肝脓肿，并伴有转移性眼内炎，该变种被定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiella pneumoniae,hvKP)，此后世界范围内相继报道类似感染病例，在中国、新加坡、韩国、日本等亚太地区尤为常见，成为一种公共卫生安全的新威胁[1]。与引起医院获得性感染的经典肺炎克雷伯菌(classicKlebsiella pneumoniae,cKP)不同，hvKP的典型特征是倾向于感染无基础疾病的年轻机体，导致肝脓肿、肺炎、眼内炎、脑膜炎等严重疾病，亦可继发迁徙性播散而出现多器官症状，严重者甚至危及生命[2-3]。令人担忧的是，相关研究数据显示hvKP的流行病学发生了重大转变，可能正在取代cKP成为医院和医疗保健相关感染的主要致病类型[4]。传统观点认为，肺炎克雷伯菌的高毒力和多重耐药在基因组上几乎没有重叠，故大部分hvKP对除氨苄西林外的常用抗生素都保持高度敏感[5]。然而，随着抗生素的不断选择以及耐药质粒的传播，hvKP耐药率呈连年升高趋势，甚至出现碳青霉烯类耐药株(carbpenemresistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CRhvKP)，给临床抗感染治疗带来极大阻碍[6-7]。

尽管有大量与hvKP相关的文献报道，但国际上仍无统一的hvKP定义标准[8]。已报道的研究使用各种评价标准，如拉丝试验阳性、特定的荚膜血清型或毒力基因，亦有基于临床表现结合病原菌分离来定义hvKP[9]。这使得不同研究数据之间可能难以解释和比较。基于流行病学分析和感染的快速诊断等多方需求，目前迫切需要关于hvKP的准确表征或客观鉴定方法，为此，本文就hvKP的实验室鉴定方法进行如下综述。

1 hvKP的表型鉴定

1.1 高黏性表型

hvKP常表现为高黏性表型，即菌落在血平板上生长呈高黏液性，这种高黏性能是hvKP抵抗中性粒细胞吞噬和宿主细胞免疫杀伤的物质基础，与其高毒力特征密切相关。因此，在某些较早文献中hvKP又被称为高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae，hmKP)。高黏性表型可通过黏液拉丝试验(string test)来初步判断，将菌株接种于血琼脂平板，37℃培养16～18 h，用接种环轻柔向上挑起菌落，重复两次，若挑起的黏液丝长度≥5 mm，即为拉丝试验阳性，称菌株为高黏性表型。拉丝试验是一种半定量试验，无需特殊仪器，操作简便，结果易于判断，故以往研究常将拉丝试验作为hvKP的筛选试验。

Tan等[10]研究发现在鉴定与原发性肝脓肿相关的肺炎克雷伯菌菌血症分离株中，拉丝试验重复性超过95%，根据拉丝长度截断值不同(5、10和15mm)，灵敏度和特异度分别介于66%～90%、64%～67%，但是阳性预测值小于35%。另一项来自日本的横断面研究显示[11]，采用拉丝试验鉴定引起血流感染的hvKP，灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为69.2%、89.5%、60.0%和92.7%。由此可见，拉丝试验虽然操作简单，但鉴定hvKP的阳性预测值却不高，可能造成hvKP漏检，给临床感染控制带来困难，尤其不适合作为hvKP低流行地区的确定性试验。随着研究深入，新的证据表明高黏性和高毒力是肺炎克雷伯菌两种不同的表型，虽然有很多相似之处却不能完全等同，即hvKP不一定具有高黏性，高黏液性肺炎克雷伯菌也不一定具有高毒力[12]。所以仅凭拉丝试验阳性来鉴定hvKP并不十分可靠，有必要识别高毒力表型背后的遗传决定因素，以开发有效的方法来快速鉴定hvKP。

1.2 高毒力荚膜血清型

荚膜多糖既是肺炎克雷伯菌重要的抗原物质，也是其主要的毒力因子。根据荚膜多糖结构及抗原性不同，可将肺炎克雷伯菌分为至少82个荚膜血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54和K57携带多种毒力基因，与各种侵袭性感染密切相关，是hvKP常见的高毒力血清型[13]。根据比较荚膜多糖合成基因的序列差异，以特异性区域设计引物靶点，通过PCR扩增技术确定高毒力血清型，可以初步筛选出hvKP。多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是通过PCR扩增多个管家基因的核苷酸序列，结果以序列分型ST表示，常用于分析肺炎克雷伯菌菌株间的变异及流行特征。

K1、K2血清型是引起肝脓肿的主要高毒力血清型，也是临床上最常见的hvKP血清型[14]。hvKP不同ST分型与血清型存在较强相关性，ST23常存在于K1血清型，ST29、ST65、ST86和ST375常存在于K2血清型[15]。

针对K1血清型hvKP，浙江大学张嵘教授团队[16]报道了一种可以进行快速鉴定的方法，该方法利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，通过测试遗传算法(GA)、支持向量机算法(SVM)、监督神经网络算法(SNN)和快速分类算法(QC)，对K1血清型和非K1血清型菌株进行区分，其中SVM算法最为可靠，其鉴定准确率超过90.0%。

针对K2血清型hvKP，Bialek-Davenet等[17]设计了一种多重PCR方法来鉴定其常见的克隆序列，包括ST86、ST380、ST679、ST65和ST375，多重PCR分析将有助于更好地确定新出现的肺炎克雷伯菌毒力克隆的流行病学。

由于肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药株和高毒力株，可能具有交叉传播性，能够在医院和社区造成严重感染。应对这个新出现的问题，Yu等[18]设计了3种多重PCR方法，能够准确区分CR-hvKP的ST258、ST11型菌株和hvKP的ST23、ST65、ST375、ST86型菌株，还可检测K1、K2、K位点47(KL47)和KL64荚膜血清型。该方法可作为CR-hvKP和hvKP分子监测的有效工具，以识别和跟踪这些菌株的传播，提供及时的感染控制信息。

除PCR方法外，Siu等[19]还研发一种基于胶体金的新型免疫层析条(immunochromatographic strip，ICS)，含有抗荚膜多糖抗原的多克隆抗体，能够特异性鉴定K1、K2血清型hvKP。ICS简单快速，不需要熟练的操作人员或专用设备，且检出限达到105CFU，室温下储存稳定6个月，可作为筛选大量样本(如流行病学研究)的快速工具。ICS还能在5 min内直接检测脓液引流样本或血培养阳性样本中的K1、K2血清型hvKP，鉴定准确性可与PCR方法相媲美[20]。

2 hvKP的毒力基因鉴定

2.1 毒力基因概况

与hvKP毒力相关的基因有很多，主要涉及荚膜多糖、菌毛、铁载体等方面。黏液表型调节基因A(regulator of mucoid phenotypegene A，rmpA)/rmpA2和黏液相关基因A(mucoviscosity-associated gene A，magA)调控荚膜多糖合成，使hvKP具有抵抗细胞吞噬的能力，是hvKP重要的毒力因子，常作为鉴定hvKP的标志基因。细菌通过菌毛介导与宿主细胞接触或黏附于黏膜表面，hvKP的黏附相关因子主要包括I型、III型菌毛，分别由fim、mrk基因调控。铁是细菌生长繁殖最基本的营养元素，hvKP只有通过额外分泌铁载体才能从宿主体内获取铁，铁载体主要有肠杆菌素(enterobactin)、耶尔森菌素(yersiniabactin)、沙门菌素(salmochelin)和气杆菌素(aerobactin)，与此相关的重要调控基因包括iroBCDN(沙门菌素生物合成)，iucABCD(气杆菌素生物合成)和iutA(气杆菌素转运蛋白)。Russo等[21-22]首次证实在hvKP的4种铁载体中，气杆菌素可以明显提高hvKP在体内外模型中的存活率，是介导hvKP毒力的关键因子。气杆菌素合成蛋白是hvKP最有前途的抗毒靶点，有望开发出新型hvKP抗菌剂[23]。由于气杆菌素常表达于hvKP，其相关生物合成基因簇iucABCD和转运蛋白编码基因iutA成为鉴定hvKP的重要指标[24]。

近年来，一些新的hvKP毒力基因不断被发现。2017年，Bulger等[25]报道一种新的毒力因子：peg344，它存在于hvKP毒力质粒上并广泛流行，相关动物实验显示，hvKP攻击肺部后需要peg344才具有完全毒力，而攻击皮下则不需要，表明peg344是一种内膜转运蛋白。2018年，Palacios等[26]研究发现两种新的hvKP毒力调节因子：kvrA和kvrB，并证实它们通过调控hvKP荚膜的表达从而影响菌株毒力。这些研究成果扩展了研究者对hvKP毒力因子的认识，也为鉴定hvKP奠定下基础。

2.2 多重PCR鉴定毒力基因

与常规PCR相比，多重PCR在检测毒力基因和血清型上更有连续性且快速，使其能够便捷、有效地对临床样本进行实验室检测，常在研究中用于鉴定hvKP。虽然hvKP众多的毒力因子携带率均处于高水平，但尚未找到某一个标志物能独立代表高毒力菌株，故有学者提出hvKP的生物学标志可能是几种毒力因子的组合。

为了探索高诊断性能的基因型或表型生物学标志，Russo等[27]纳入来自北美及英国的hvKP、cKP临床分离株，使用流行病学和动物模型对这些分离株的多个关键基因型标记物进行评估。该研究结果显示peg344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2在鉴定hvKP方面，诊断准确度大于95%；小鼠脓毒症模型中，这5种基因与严重疾病或死亡的风险比均大于25。若将peg344和iucA组合应用，则可将鉴定准确性提高至98%。此外，定量铁载体的产生量≥30 μg/mL也可用于hvKP的预测，准确度为96%，并显示出与严重疾病或死亡的风险比为31.7，表明定量铁载体溶液测定法具有极佳的鉴定性能，尽管尚无法在实验室中进行直接测量，但相信将来很有可能得到发展和应用。徐水宝等[28]研究也发现rmpA2、magA、fimH、aero、iutA、kfuBC可作为hvKP的分子标志物，尤其iutA诊断效能最高。这些数据有力地支持了毒力基因用于鉴定hvKP的高准确性，有助于开发出更多的快速多重PCR检测手段。

尽管拉丝试验曾被作为鉴定hvKP的常用方法，但如今的研究多以hvKP的毒力基因作为鉴定分子标志物，或以拉丝试验与毒力基因组合应用，并逐渐被学术界所认可。笔者将近年来文献报道的多重PCR方法鉴定hvKP进行总结，如表1所示，可以看出，以一种或多种毒力基因组合作为hvKP鉴定方法已成为研究趋势。

表1 近年来文献中关于hvKP的定义标准Tab.1 Standards of hvKP in literatures in recent years

2.3 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)鉴定毒力基因

环介导等温扩增技术是在单一恒定温度下使用4～6个引物，通过链置换DNA聚合酶快速扩增获取新DNA的一种方法。Liao等[41]利用LAMP识别peg344基因靶位，建立了hvKP的快速分子诊断方法。该团队所设计的LAMP能在65℃下特异性地将hvKP和cKP区分开，60 min内即可完成检测，灵敏度是普通PCR方法的100倍，而且检测到的hvKP毒力表型与小鼠致死率试验及血清杀伤试验一样精确。LAMP扩增过程不需要热循环仪，也不需要电泳即可观察到扩增产物，操作简便、快速，可用于实验室常规鉴别hvKP和cKP。以peg344基因为靶点的LAMP，极有可能将成为欠发达地区开展hvKP流行病学调查的有力工具。

2.4 MALDI-TOF MS技术鉴定毒力基因

MALDI-TOF MS作为一种新型的软电离生物质谱，具有快速、准确及高通量等强大优势，已成为一项高效的微生物快速鉴定技术，逐渐应用于临床微生物实验室。与此同时，该技术在鉴定hvKP毒力基因方面也引起学者们的关注。孙巧玲等[42]研究证实MALDI-TOF MS可以快速区分携带rmpA2毒力基因的hvKP，灵敏度和特异度都在90%以上。值得注意的是，MALDI-TOF MS为快速检测hvKP毒力基因方面提供了思路，但仍需展开进一步临床验证。

2.5 毒力质粒鉴定

随着基因测序技术的广泛应用，宏基因组测序结果显示大部分hvKP都携带一个约220kb大小的质粒(pLVPK)，或这个质粒的一部分(pLVPK-like)。通常pLVPK质粒包含4个主要毒力基因(iucA、rmpA、rmpA2、iroN)，若这4个基因全部检出，说明菌株携带完整的pLVPK质粒；若只是部分检出，说明菌株携带的pLVPK-like质粒。Struve等[43]研究中检测到的所有hvKP克隆谱系均含有pLVPK质粒，该质粒具有高度保守性，编码气杆菌素、沙门菌素以及rmpA2，表明毒力质粒在hvKP致病中发挥重要作用。因此，有文献将pLVPK质粒作为鉴定hvKP的生物学标志[44]。

毒力质粒在推动hvKP耐药性的快速传播方面也发挥着关键作用。Gu等[45]报道了浙江某大型医院重症监护病房暴发由CR-hvKP引起的呼吸机相关肺炎，测序结果显示所有的CR-hvKP均属同一个ST11型克隆株，这些CR-hvKP出现是因为ST11型CR-KP菌株获得pLVPK-like毒力质粒。毒力质粒几乎都携带数个毒力基因，在鉴定hvKP方面具有独特优势，但由于需要对菌株进行基因组测序，价格昂贵，难以在普通实验室广泛开展，目前多应用在科研或疑难菌株鉴定方面。

3 hvKP的毒力评估

3.1 抗中性粒细胞吞噬试验

中性粒细胞吞噬在机体抗细菌感染的先天性免疫反应中发挥重要作用，荚膜多糖使肺炎克雷伯菌能够对抗中性粒细胞的吞噬作用，并介导菌体逃避或抵抗宿主的免疫杀伤。吞噬和胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞的胞内和胞外抗菌机制，而hvKP在抵抗中性粒细胞介导的吞噬及细胞内杀伤的能力均明显强于cKP，还能抵抗中性粒细胞产生的NETs捕获作用[46]。舒玲斌等[47]研究显示抗中性粒细胞吞噬试验耗时短，成本低，结果易于判断，是判断hvKP毒力的简单有效方法。因此，抗中性粒细胞吞噬试验作为衡量hvKP毒力的重要标准之一，可作为鉴定hvKP的辅助方法。

3.2 动物感染模型

动物感染模型最大的优点是可以直观地表现出细菌毒力的大小，因此被广泛用于评估病原体的毒力。hvKP因具有独特的表型以及携带多种毒力基因，毒力往往很强，少量细菌即可造成小鼠死亡，半数致死量(LD50)多在1×103以下。然而，此类动物模型成本昂贵，试验周期长，且需要使用生物安全2级设施，所以并不适用于大规模检测。大蜡螟是近20年中开发的高通量动物模型，其幼虫成本低廉，易于获得，可以在较宽温度范围内饲养，是评估肺炎克雷伯菌毒力相关因素的有效模型，在菌液接种12h后即可进行毒力的检测[48]。Shi等[49]研究还证实大蜡螟感染模型的LD50适合验证hvKP的毒力水平，评价效果准确。因此，大蜡螟感染模型在越来越多的研究中被用于评估hvKP的毒力。

然而，Russo等[50]最新研究发现远交小鼠感染模型对于区分hvKP和cKP非常准确，但在大蜡螟感染模型中观察到hvKP和cKP毒力的显著重叠，表明大蜡螟感染模型还不能完全准确区分hvKP和cKP。为了提高鉴定准确性，Li等[51]采用大蜡螟毒力试验与拉丝试验相结合的方式来鉴别hvKP和cKP，灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均明显高于仅用大蜡螟毒力试验获得的值。可以看出，采用大蜡螟毒力试验与拉丝试验相结合是一种相对简便、准确鉴别hvKP和cKP的方法。

4 结语

目前，hvKP的感染病例早已从最初的亚洲地区蔓延至全球范围，针对hvKP的研究也有长足进步，但仍无绝对特异性的鉴定指标，通常还是基于hvKP的独特表型和基因型这两个方面做出判断。传统拉丝试验操作简单，在临床上初步筛查高毒力菌株还是具有一定的参考意义。从分子生物学角度检测hvKP相关的毒力基因、荚膜血清型、ST分型，亦或是利用动物感染模型验证高毒力，均可增加hvKP鉴定的准确性。新兴的MALDI-TOF MS技术、宏基因组测序技术，与传统的基因分析技术联合应用，有望为临床提供快速的病原学证据，从而及时有效治疗hvKP引起的感染。