907例复温脐血造血干细胞质量的分析

钱坤，贺雪萍，王立业，韩俊领

协和干细胞基因工程有限公司(天津 300384)

脐血造血干细胞(Hemopoieticstemcells，HSCs)有着自我更新和多向分化的生物学功能。脐血作为一种珍贵的生物资源，已成为异基因造血干细胞移植中一个重要的干细胞来源，被越来越广泛地应用于儿童及成人的恶性和非恶性血液病的治疗[1]。世界范围内脐血库冻存脐血超过600000份备用查询[2]。脐血供体的选择通常以HLA匹配和有核细胞总数(totalnucleatedcells，TNC)为主要依据，CD34+细胞总数和总集落形成单位(colony-formingunits,CFU)也是评估造血潜能的重要参数。脐血冷冻和复温过程会对HSCs质量产生影响[3]。本研究分析大量复温脐血HSCs的检测数据，旨在探究深低温冻存和复温过程对脐血HSCs生物学功能的影响程度，从而为临床应用前对脐血质量的评估提供更有力的依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 脐带血的采集 分析天津脐带血造血干细胞库2018至2020年度907份复温脐血样本。脐血采集的对象为经筛选合格且志愿捐献的足月正常分娩者，脐血采集前均经产妇本人同意并签署《脐带血捐献知情同意书》。婴儿娩出断脐后即从静脉穿刺抽取脐血注入含有枸橼酸磷酸盐抗凝剂的采血袋中混匀，于24小时内进行分离处理。

1.1.2 主要试剂与仪器 流式细胞仪；CO2恒温培养箱；程控降温仪；血细胞分析仪。甲基纤维素培养基；CD34-PE；mouse IgG1-PE；CD45-FITC；7-AAD；6%羟乙基淀粉；Cryosure-DEX40细胞冻存液。

1.2 方法

1.2.1 脐血的分离与冷冻 按照本脐血库标准操作规程，将羟乙基淀粉与每份脐血以1∶4的比例充分混匀，经二次沉淀分离法制备富含有核细胞的血浆，再与细胞冻存液以4∶1比例在冰水浴中充分混匀，转移至冷冻袋，经程控降温仪降温至-80℃后保存于-196℃液相液氮罐中。

1.2.2 脐血的复温 将待复温脐血的预留检测辫管从液氮罐中取出在37℃～42℃的水浴中快速混匀融化，融化后立即抽取2mL样本进行各项检测。

1.2.3 复温脐血的检测 应用血细胞分析仪检测白细胞(Whitebloodcell，WBC)，根据TNC=WBC×体积(L)计算TNC。应用甲基纤维素培养基检测CFU，将脐血标本经溶血、洗涤处理后制备成细胞悬液，以1×105/mL的浓度接种于24孔板内,放置于CO2恒温培养箱中，CO2浓度5%，湿度100%的条件培养14天，用倒置显微镜计数集落形成单位。根据CFU=集落形成单位计数/1×105×TNC计算CFU。按照血液病治疗与移植国际联合会(InternationalSocietyofHematotherapyandGraftEngineering，ISHAGE)方案检测出有核细胞活率、CD34+细胞活率、CD34+细胞百分率。以CD45-FITC、CD34-PE、7-ADD标记样本，IgG1-PE作为同型对照，应用流式细胞仪收集75000个有核细胞，分别圈选出CD34+细胞群(即CD34+，CD45dim+，7-AAD-，lowSSC，FSC与淋巴细胞相似)和有核细胞群(CD45+，7-AAD-)，并用CellQuest pro软件计算出有核细胞活率、CD34+细胞(HSCs)活率、CD34+细胞百分率。

1.3 统计学处理

应用SPSS Statistics 23软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，相关数据的离散程度以变异系数CV表示，冻存前后计量资料的比较采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 复温脐带血基本情况

907份脐血平均冻存时间为(55.26±35.19)个月；TNC冻前为(11.14±3.31)×108，复温后为(9.67±2.89)×108，回收率为(86.86±5.99)%，变异系数CV值为6.90%；CD34+细胞总数冻前为(32.29±22.98)×105，复温后为(37.58±27.48)×105，回收率为(120.74±36.32)%，CV值为30.08%；CFU冻前为(9.86±3.83)×105，复温后为(9.08±4.42)×105，回收率为(96.31±40.82)%，CV值为42.38%；复温后有核细胞活率为(91.33±4.02)%，复温后HSCs活率为(98.86±0.13)%。见表1。

表1 复温脐带血基本情况

2.2 复温脐带血各检测项目冻存前后的差异性分析

907份脐血复温后TNC比冻存前显著减少(Z=26.09，P<0.01)；CD34+细胞总数比冻存前增加的有619例，减少的有288例，与冻存前有显著差异(Z=12.63，P<0.01)；CFU比冻存前增加的有372例，减少的有535例，与冻存前有显著差异(Z=6.34，P<0.01)。见表2。

表2 复温脐带血各检测项目冻存前后差异性分析

3 讨论

脐血存储技术在我国发展已有20余年，逐级程控降温、冷冻保护剂的使用、冻存温度的控制以及复温过程的技术已经比较成熟。细胞冻存采用甘油或二甲基亚砜作为保护剂，提高细胞膜对水的通透性；程控降温技术使细胞内水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成；复温时快速融化的方法也可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，最大程度避免对细胞的损伤。但HSCs仍因冻存、复温过程和延长储存时间等因素而受到损害[4]。由于脐血中细胞免疫原性较低，HLA配型成功率高，临床筛选脐血时，多以冻存前的各项检测数据评估脐血的质量。但冻存前的检测数据是否能真实反映复温后HSCs的生物学功能呢？

在本研究中，复温后TNC的回收率为(86.86±5.99)%，与冻存前相比显著下降(Z=26.09，P<0.01)，表明冻存和复温的过程会导致部分脐血细胞死亡。复温后有核细胞活率为(91.33±4.02)%，CD34+细胞活率为(98.86±0.13)%，显著高于有核细胞活率。证明了非HSCs的有核细胞受冻存复温的影响大于HSCs。贺雪萍等[5]通过比较双平台ISHAGE法和单平台绝对计数法发现低温冻存后有核细胞的组分会发生变化，中性粒细胞明显下降，CD34+细胞占比有核细胞比例比冷冻前出现升高趋势，导致计算出的CD34+细胞的百分数、总数和回收率较冻存前升高。这也解释了本研究中复温后CD34+细胞总数与冻存前相比有显著差异(Z=12.63，P<0.01)的原因。

HSCs的生物学功能包括自我更新和多向分化。在体外培养的环境下，在半固体培养基上生长的CFU是由造血干(祖)细胞分化而来，因此CFU检测能够评估脐血中HSCs生物学功能。本研究中复温后的CFU与冻存前相比有显著差异(Z=6.34，P<0.01)，CFU回收率为(96.31±40.81)%，变异系数CV为42.38%，数据离散程度很大，表明CFU受冻存复温过程的影响程度呈现个体差异，不具有一致性，与冻前相比减少的有535例，表明近60%的复温HSCs样本生物学功能有不同程度的减弱，我们推测这种差异的产生和新生儿的自身免疫力有着相关性。

综上所述，脐血作为HSCs的重要资源，深低温冻存和复温技术日益发展，但仍对脐血中的细胞有一定程度损伤，对HSCs损伤已经降至很低的程度，未受损伤的HSCs的增殖分化生物学功能也有着不同程度的降低。复温后各检测数据与冻前相比均有显著差异，临床应用前对脐血的质量评估应以复温后的检测数据为主要依据。同时建议各地脐血库应建立脐血捐献者的健康随访档案，关注捐献者的健康状况，这样做一方面可以进一步开展影响HSCs生物学功能相关性的研究，另一方面可以对配型合格的脐血进行全面的干细胞数量和质量评估，为临床评估干细胞移植效果提供更有力的依据。