混合磷酸盐法制备螺旋藻磷酸酯多糖的研究※

●李淑玲 崔 晶 雷 婕 邓猛猛 张喜峰，2※※

（1.河西学院 生命科学与工程学院 甘肃 张掖 734000；2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室 甘肃 张掖 734000）

多糖广泛分布于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁，是构成生命的四种基本物质之一。多糖具有抗氧化、抗癌和抗病毒等多种生物活性[1-3]，广泛应用于食品和医药领域[4-5]。多糖的开发利用是目前生命科学领域研究的热点之一。

大量研究表明，多糖的生物活性与聚合物的分子特性密切相关，如单糖组成、分子量、溶液构象等[6]。此外，多糖通过化学修饰改变了多糖分子性质和生物活性，修饰后多糖的分子量和链构象将受到带电基团的影响[7]。磷酸化是多糖支链中的羟基被游离磷酸基取代的过程。磷酸化多糖具有显著的抗氧化、抗肿瘤和抗凝活性[8]，证明磷酸化方法无毒、无害[9]，并能提高生物活性。螺旋藻多糖是螺旋藻中的重要活性成分之一，然而有关其改性修饰的研究相对较少。因此，本研究以螺旋藻多糖为材料，采用混合磷酸盐法制备磷酸酯多糖，旨在为螺旋藻多糖及其衍生物的深度开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻多糖（分子量为3.597×104），纯度为86.17%，由本实验室自制。KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、尿素、钼酸铵、抗坏血酸、浓硫酸、浓盐酸、硝酸等试剂为分析纯，购自烟台市双双化工有限公司。

1.2 主要仪器

722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；DKB-501型数显超级恒温水浴锅，扬州市三发电子有限公司；JA2003型万分之一精密电子天平，上海研丰电子科技有限公司；FTIR-650S型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技发展股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 螺旋藻多糖磷酸酯制备方法取一定量螺旋藻多糖，按照1∶50质量比加入蒸馏水，制备多糖溶液，加入一定量质量比为3∶1的NaH2PO4与Na2HPO4，加入相应量的尿素，混合均匀，在一定温度下反应一段时间后，透析48 h，冷冻干燥后获得粉末状螺旋藻磷酸酯多糖。

1.3.1.1 反应时间对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响设置混合磷酸盐用量为螺旋藻多糖用量的30%，尿素用量为螺旋藻多糖用量的5%，反应温度为60℃，考察不同反应时间（3，4，5，6，7 min）对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响。

1.3.1.2 反应温度对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响设置混合磷酸盐用量为螺旋藻多糖用量的30%，尿素用量为螺旋藻多糖用量的5%，反应时间为5 min，考察不同反应温度（40，50，60，70，80℃）对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响。

1.3.1.3 尿素用量对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响设置混合磷酸盐用量为螺旋藻多糖用量的30%，反应温度为60℃，反应时间为4 min。考察不同尿素用量（5%，10%，15%，20%，25%）对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响。

1.3.1.4 磷酸盐用量对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响设置反应温度为60℃，反应时间为4 min，尿素用量为螺旋藻多糖用量的15%。考察不同混合磷酸盐用量（30%，40%，50%，60%，70%）对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响。

1.3.2 螺旋藻磷酸酯多糖取代度的测定

1.3.2.1 标准曲线的绘制称取磷酸二氢钾0.5 g，用蒸馏水溶解后稀释，充分振荡混匀，并定容于100 mL的容量瓶中，为5 g/L的标准物质储备液。精密吸取配制的标准物质储备液0，1，2，3，4，5，6，7，8 mL，分别移入9个50 mL容量瓶中，依次分别加入10 mL质量分数为26%的硫酸溶液、5 mL质量分数为2%的钼酸铵溶液、2 mL质量分数为5%的抗坏血酸溶液， 振荡使其混合均匀，沸水浴加热 10 min，立即用冷水迅速冷却，并定容至50 mL，得到浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 的工作液。将磷酸二氢钾溶液在820 nm波长处测定吸光度值，并根据所得数据绘制标准曲线，由此得到回归方程：

其中，y是吸光度值，x是所对应的磷酸二氢钾的质量浓度（g/L）。

1.3.2.2 总磷的测定取0.1 g螺旋藻磷酸酯多糖样品，加入H2SO4-HNO3混合液（硝酸∶硫酸=5∶2）进行消化，直至液体清亮后冷却定容。吸取上述液体1 mL加入容量瓶中，并依次加入10 mL质量分数为26%的H2SO4溶液、5 mL质量分数为2%的钼酸铵溶液、2 mL质量分数为5%的抗坏血酸溶液，充分振荡混匀，加热后显色，立即用冷水冷却至室温，最后定容至50 mL，在820 nm处测定吸光值。

1.3.2.3 游离磷的测定取0.1 g制得的多糖磷酸酯样品，加入10 mL浓度为2 mol/L HCl溶解后定容至50 mL。吸取上述溶液1 mL加到50 mL容量瓶中，依次加入26%的H2SO4溶液10 mL、2%的钼酸铵溶液5 mL、5%的抗坏血酸溶液2 mL，震荡混匀，加热后显色，之后迅速冷却至室温，最后定容至50 mL，在820 nm处测定吸光值。

1.3.2.4 取代度的计算根据所得到的磷的标准曲线的回归方程即式（1）算出样品当中所含总磷的质量分数以及游离磷的质量分数。而结合磷的质量分数按照式（2）计算：

取代度DS按式（3）去计算：

式中：162是单糖的摩尔质量（g/mol）；31是磷的摩尔质量（g/mol）；3.32是游离磷能够换算成结合磷酸酯基团的系数；P是所算出的结合磷的质量分数（%）。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析研钵中加入比例为1∶100的尿素和KBr，将其研磨，成粉末状后，取一定量将其放在专用模具上，制样；将样品在波长 4 000~400 cm-1 范围进行光谱扫描（1 min扫描，KBr分束器，DTGS检测器，4 cm-1光谱分辨率），重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 反应时间对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响

不同反应时间下螺旋藻磷酸酯多糖取代度，见图1。

图1 不同反应时间下螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由图1中可得，随着反应时间增加，螺旋藻多糖磷酸酯取代度（DS）就增加，反应时间越长，磷酸化反应越充分，在反应时间达到 4 min时，取代度达到最大值，随后取代度有所下降，分析原因可能是因为反应时间过长，引起螺旋藻磷酸酯多糖的降解。因此，确定最佳反应时间为4 min。

2.2 反应温度对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响

不同反应温度下螺旋藻磷酸酯多糖取代度，见图2。

图2 不同反应温度下螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由图 2可知，随着温度的升高螺旋藻磷酸酯多糖的取代度快速增加，而对于酯化反应，温度的升高有利于反应的进行。当反应温度为60 ℃时，螺旋藻磷酸酯多糖的取代度最高，在此基础之上继续提高反应温度，取代度会降低，说明较高的反应温度可能会造成原来多糖的结构破坏，从而影响多糖的取代度，因此，确定最佳反应温度为 60 ℃。

2.3 尿毒用量对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响

不同尿毒用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度，见图3。

图3 不同尿素用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由图3可知，随着尿素用量增加，取代度（DS）增加，当尿素用量为螺旋藻多糖用量的15%时，取代度最高，之后取代度下降，原因可能是因为尿素用量的增多使得反应体系的碱性增强，从而造成了螺旋藻磷酸酯多糖的水解，确定最合适的尿素用量为螺旋藻多糖用量的15%。

2.4 磷酸盐用量对螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影响

不同磷酸盐用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度，见图4。

图4 不同磷酸盐用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由图4可知，随着混合磷酸盐用量的增加，螺旋藻多糖磷酸酯化的取代度快速增加，这说明较大的质量比有利于多糖接触到更多的混合磷酸盐，有利于反应的进行。当混合磷酸盐用量达到螺旋藻多糖用量的50%时，螺旋藻磷酸酯多糖的取代度最高，随后取代度逐渐下降。在以上最优条件下，平均取代度为0.728，以螺旋藻多糖计，螺旋藻磷酸酯多糖得率为26.84%。

2.5 红外光谱

经检测得到螺旋藻多糖和螺旋藻磷酸酯多糖的红外光谱（图5）。

图5 样品的红外光谱图

螺旋藻磷酸酯多糖典型的吸收峰存在于4000～1000 cm-1波数范围内，然而，在3300 cm-1附近处有一个强吸收峰，查阅资料可以得出这是螺旋藻多糖分子中O-H的伸缩振动峰，而在2929 cm-1处所出现的峰则属于CH2和CH3的C-H拉伸所导致[10]。螺旋藻磷酸酯多糖在1337～1246 cm-1出现了新的弱峰，这是P-O的伸缩振动引起的，而在936 cm-1处的一个弱峰是由P-O-C的伸缩振动引起的，此结果与赵鹏等[8]制备磷酸酯多糖结果基本相符，说明得到的产品确定为螺旋藻磷酸酯多糖。

3 结论与讨论

采用混合磷酸盐法制备螺旋藻磷酸酯多糖最佳工艺参数为反应时间4 min，反应温度60℃，尿素质量分数15%，混合磷酸盐用量为螺旋藻多糖总量的50%，在此条件下平均取代度为0.728，以螺旋藻多糖计，螺旋藻磷酸酯多糖得率为26.84%。红外光谱分析发现，螺旋藻磷酸酯多糖1337~1246 cm-1出现了新的弱峰，这是P-O的伸缩振动引起的，而在936 cm-1处的一个弱峰是由P-O-C的伸缩振动引起的。

在今后研究中，将进一步探讨通过其他合成方式来提高反应效率，并对其生物学活性进行修饰前后的比较研究，为螺旋藻多糖的进一步利用和其他多糖的磷酸化深入研究提供思路。