蒲公英石蜡切片技术研究※

●张馨文 刘丽萍 ※※

（1.黑龙江大学生命科学学院农业微生物技术教育部工程研究中心 黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校分子生物学重点实验室 黑龙江 哈尔滨 150080）

1 蒲公英概述

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz）是我国重要的观赏植物和食药用材料，蒲公英为菊科多年生草本植物，头状花序，种子为由白色冠毛组成的细绒毛，成熟后会随风飘到各处进而开花、生根。人们也习惯于把蒲公英属草本植物统称为蒲公英。蒲公英的生命力很强，多生于坡地、草丛、路边、岸边沙地上和田野间，为常见的野生植物。蒲公英的适应性范围很广，即抗寒又耐热、抗酸碱等，能在各种类型的土壤中正常生长发育。

2 蒲公英的食用价值

蒲公英的植株中富含蒲公英醇、蒲公英素、胆碱、有机酸、菊糖、黄酮素等各种营养元素，而蒲公英根富含蛋白质、油脂、氨基酸、维生素等物质。蒲公英可以生食、炒食或作汤，是药食并用的植物。还可以以蒲公英提取物和水果等为原料制成酸奶、冰糖梨汁、果酒等风味饮品，既能消暑解渴，又可以预防疾病。

3 蒲公英的药用价值

蒲公英的药用价值及经济价值都较高，其根茎、叶均有保健作用。在临床上，蒲公英根一般用来治咽疼痛、疔疮肿毒、湿热黄疸和热淋涩疼等病症。将蒲公英根部掐断后会流出类似于白色奶汁状的乳汁，因此蒲公英别名奶汁草，蒲公英的乳汁管分泌的汁液含有丰富的蛋白质及矿物质，具有清热去火、消炎解毒、降低胆固醇、通便等功效，具有很好的应用前景和研究价值。同时，蒲公英对消化不良、胆管疾病、脾脏和肝脏疾病以及炎症性疾病也有治疗作用。此外，蒲公英中的黄酮类化合物能够抑制人乳腺恶性肿瘤的增殖。适量地添加蒲公英提取物能促进鱼类的白细胞增加[1-3]。

4 石蜡切片的概述

石蜡切片是目前组织学常规制片技术中较为广泛的方法，该方法可以直接观测到正常细胞组织的形态结构。本试验制作并观察蒲公英根部的横切面和纵切面，查阅相关石蜡切片的研究，未见蒲公英石蜡切片的乳汁管结构方面的研究。

5 蒲公英石蜡切片的制作

5.1 试验材料与试剂

5.1.1 试验材料蒲公英根尖，试剂主要有石蜡、乙醇、二甲苯、番红/固绿染色液、明胶、甲醛、甘油、苯酚。

5.1.2 器具主要有石蜡切片机、组织脱水机、展片台、恒温箱、染色缸、载玻片、盖玻片、烧杯、量筒等。

5.2 取材

试验所用蒲公英于哈尔滨市南岗区学府路和学府三道街取材，取材时动作应快、轻且用力均匀，可借助解剖镜切取所需试验材料。

5.3 固定

对切好的蒲公英根组织加以固定，固定应及时，根组织离体后，越快固定越好。固定液的选择应遵循贯穿力强，使细胞迅速死亡，将原生质全部凝固且不引起任何变形的原则，与此同时提高折光率，而且不妨碍正常组织结构。固定液的用量为物料容积的20～50倍，不然物料中的水会稀释固定液的含量，减低固化效率[4-6]。本试验使用FAA固定液，FAA固定液是一种常见的固定液，其兼有保存剂的功能。将蒲公英的根横切面与根纵切面在FAA固化液中固定24 h后充分水洗，去掉留在组织内的固化液以及结晶沉淀，避免影响后期的染色效果。

5.4 脱水与透明

水与透明剂之间不可互溶，只有脱去水分后，透明剂方可进入组织切片。在脱水处理时，要注意确定脱水反应梯度和每一个脱水反应的时间，一定要完全脱水，但同时又不可过量，因脱水时间过长会使组织变脆、萎缩。脱水反应的具体操作步骤：采用50%、70%、85%、95%、100%的各级乙醇溶液系列脱水反应各40～60 min，可保证脱水透彻，还可以用自动组织脱水机进行快速脱水[7]。

二甲苯也是最常见的透明剂，能够很好地与石蜡互溶，同时它还具有作用速度快、澄清能力强等优点，将脱水后的蒲公英的根横切面与根纵切面先在纯酒精和二甲苯的等比容积的混合物中停留约1 h，而后进入纯二甲苯中停留约1 h后，再更换纯二甲苯2次。

5.5 浸蜡与包埋

浸蜡时以石蜡代替透明剂，使石蜡渗透到植物组织中而起支持作用。浸蜡一般在恒温箱中进行，恒温箱温度约为60℃，将已经透明的蒲公英根横切面与根部纵切面用镊子分别取出，放入蜡杯内，然后再将碎石蜡（熔点48～50℃）放至蜡杯约2/3处，加盖后置于60℃温箱中，并放置约24 h后进行溶蜡。24 h后揭去蜡杯的盖子，将温箱温度调至56℃并保存约5 d，使其透明剂完全挥发。超前备好包埋法所用纸箱，将经过浸蜡的蒲公英根连同溶好的石蜡一同注入纸箱，之后立即注入冷水[8]，使之迅速凝结成蜡块。使用半自动包埋机可以大大节省包埋时间，提高工作效率。待石蜡全部凝结（约30 min）后，即可取出使用。

5.6 切片并粘片

切割时的蜡块要均匀、平整，因为环境温度太高，切割时易于黏着在刀片上，可通过冰块降温来降低切割机的温度[9]。把蜡块在切割机上定位后，调节切距至合适程度，然后旋转调节器，切割厚度控制在5～10 μm，完成切割。切好后就立即开始粘片，用粘片剂将蜡片牢附在载玻片上。具体做法：在载玻片上先涂粘片剂，再滴蒸馏水，最后放上蜡片，用滤纸片吸收多余的水后把载玻片放置在40～60℃的展片台上，烤干[10]。本试验所使用的粘片剂为蛋清与甘油1∶1混合制成。

5.7 脱蜡、复水与染色

晾干后的材质切片必须经脱蜡和复水才能在水溶性染液中完成染色。脱蜡、复水和染色的总体步骤：二甲苯→二甲苯∶酒精（1∶1）→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→番红（4 h以上）→95%乙醇→固绿（迅速）→95%乙醇（迅速）→100%乙醇→二甲苯∶酒精（1∶1）→二甲苯[11]。

上述过程每一步需要5～10 min，已标注具体时间的除外。染色剂一般为1%番红（95%乙醇配制）和0.1%固绿（95%乙醇配制），在其中的1%番红染色液中10 min，用自来水冲洗除去浮色，用蒸馏水清洗，50%乙醇5 min，70%乙醇脱水5 min，0.5%固绿复染不超过25 s，二甲苯透明5 min。

5.8 封片

在二甲苯中拿出透明好的蒲公英根的横切面和根纵切面切片后，在载玻片中滴入少许的（1～2滴）加拿大树胶，让它逐渐地往外溢，用镊子把洁净盖玻片倾倒下放，等整张盖玻片的内表面部接触到树胶后，再用镊子轻盖压玻片，以赶出切片中的气泡，要使树胶层尽量薄而平整，在封片时也要小心切勿形成气泡。将封好的切片置于60℃温箱中，干燥一夜后进行镜检并将合格的切片贴上标签，然后永久保存。

6 结果与分析

将制好的蒲公英根横切面和纵切面于显微镜下观察，观察发现蒲公英根横切面如图1所示，横切：木质部小，射线明显，乳汁管丰富，导管较大，为排列着的棕色细胞，根的横切面清晰可见外圈砖红色为乳汁管的横截面，这也在一定程度上证明了蒲公英具有发达的乳汁管结构；对蒲公英的根纵切面显微观察，如图2所示，这是一个具有代表意义的典型乳汁管的石蜡切片，乳汁管呈简单的管状排列，有螺纹，其内部含有乳汁。植物乳汁管主要由一条或多条细长分支的乳汁细胞所组成，试验通过对蒲公英的根纵切面的制作获得了蒲公英乳汁管的切片，观察到了蒲公英分泌乳汁的证据，蒲公英乳汁管分泌乳汁的功能与作用有待进一步深入研究。

图2 蒲公英的根纵切面——乳汁管