鞘柄菝葜药材质量标准研究

赵春晓， 李汉伟， 苏秀红,2*， 兰金旭,2， 晁利芹

( 1. 河南中医药大学 药学院， 郑州 450046； 2. 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心 河南中医药大学， 郑州 450046； 3. 河南中医药大学 中医药科学院， 郑州 450046 )

鞘柄菝葜()为百合科菝葜属植物，其根及根茎在我国北方常作为“铁丝威灵仙”或“铁丝灵仙”入药，具有祛风除湿、活血通络、解毒散结的功效(中药大辞典，2006)。据《河南植物志》中记载，河南省菝葜属植物有14种及2变种(丁宝章，1997)，植物资源丰富，具有较大开发前景及研究价值。但该属植物形态特征和根茎性状十分相似，特别是鞘柄菝葜与同属植物糙柄菝葜()极为相似，非专业人员很难将其正确区分，同时在第四次全国中药资源普查中发现，当地群众常将其与“土茯苓”()或“威灵仙”()等错采而误用，据前人本草考证结果表明，菝葜属类同品、地区习用品及伪品诸多(李官政等，2017)，因此亟须开展相应的质量标准研究，建立质量控制体系。

鞘柄菝葜药材主要含有薯蓣皂苷元、白藜芦醇、胡萝卜苷、木栓酮等化学成分(孙学军等，1995)，其中薯蓣皂苷元具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用(何焱等，2013；王平等，2020)，白藜芦醇具有抗癌、抗病毒和抗衰老等药理作用(李雨婷等，2020)。前人多将这两种成分作为菝葜属植物含量测定指标性成分(杜素兰等，2007；陈艺粼等，2018；杨宇慧等，2020)，此外，杨宇慧等(2020)在研究同属植物短梗菝葜()和华东菝葜()时发现不同批次药材中活性成分白藜芦醇含量差异较大，故以其作为控制指标，而在鞘柄菝葜的相关研究较少。综上所述，本研究选择薯蓣皂苷元和白藜芦醇作为鞘柄菝葜指标性成分。

鞘柄菝葜药材作为地区习用品使用历史悠久、临床疗效显著，虽收载于1991年版《河南省中药材标准》、1998年版《北京市中药材标准》、2009年版《甘肃省中药材标准》、2015年版《陕西省药材标准》等地方标准，但现行标准中仅对药材性状、显微鉴别、总灰分、酸不溶性灰分进行了限制，有关粉末鉴别特征、指标性成分的鉴别等方面则未作出明确规定，而且2020年版《中国药典》仍未收录该种药材。至今，其相关质量标准研究仍旧十分单一，本课题在鞘柄菝葜现有研究基础之上，对其入药部位根及根茎的性状、显微、薄层色谱鉴别、水分、灰分、含量测定等项目进行了系统的研究，以便从源头上控制其药材质量，为建立鞘柄菝葜药材的质量标准提供理论依据，同时为同属中药材的质量标准研究提供思路与方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

实验样品采自河南省洛阳市、新乡市、安阳市、济源市等地，由河南中医药大学苏秀红教授鉴定为鞘柄菝葜()的根及根茎(表1)。

Waterse 2695-2489型高效液相(Waters科技有限公司)；薯蓣皂苷元对照品(批号：140820，质量分数≥98%)，白藜芦醇对照品(批号：140327，质量分数≥98%)均购自四川省维克奇生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 性状鉴别 对不同产地样品根及根茎的大小、性状、色泽、表面、质地、断面等特征进行观察与描述。

1.2.2 显微鉴别 采用徒手切片法观察不同产地样品根及根茎横切面的显微特征，制作水合氯醛透化片和水装片观察粉末的显微特征。

1.2.3 薄层鉴别 取样品粉末5 g，加无水乙醇50 mL，超声(500 W，40 kHz)处理30 min，滤过，滤液加36% HCl 5 mL，加热回流2 h，放冷，用40% NaOH溶液调至中性，挥至无醇味，残渣加热水40 mL溶解，用二氯甲烷振摇提取两次(40 mL，30 mL)，合并提取液，挥干，加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成0.5 mg·mL的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中国药典》通则0502)试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在烘箱中加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365 nm)下检视。

表 1 鞘柄菝葜样品的采集信息Table 1 Sample collection informations of Smilax stans

取样品粉末1 g，加10 mL甲醇，称重，超声(500 W，40 kHz)提取20 min，冷却，称重，补足重量，滤过，挥干，加甲醇定容至1 mL，作为供试品溶液。另取白藜芦醇对照品，加甲醇制成0.5 mg·mL的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用丙酮-氯仿-水-冰醋酸(4∶4∶0.2∶0.5)为展开剂，展开，晾干，置于紫外灯(300 nm)下检视。

1.2.4 检查 参照2015年版《中国药典(四部)》通则0832的烘干法、通则2302的总灰分测定法、通则2201的醇溶性(60%乙醇)浸出物测定法对不同产地样品进行水分、总灰分、浸出物的测定。

1.2.5 含量测定

1.2.5.1 薯蓣皂苷元含量测定(钱芳芳和张长林，2014；Yi et al.，2014；徐淑珍等，2015)

色谱条件 ZORBAX SB-C色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(80∶20)为流动相，流速为1 mL·min，柱温为35 ℃，检测波长为210 nm。

对照品溶液的制备 取薯蓣皂苷元对照品适量，精密称定，加乙腈制成0.560 mg·mL薯蓣皂苷元对照品溶液。

供试品溶液的制备 取不同产地药材粉末5 g，精密称定，置于索氏提取器中，加95%乙醇适量，浸渍过夜，加热回流至提取液近无色，加36%HCl 5 mL，沸水浴2 h，冷却，石油醚萃取3次(沸程60～90 ℃)，每次40、30、30 mL，合并萃取液，回收石油醚，加甲醇定容至2 mL，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

线性关系考察 取薯蓣皂苷元对照品适量，精密称定，配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7 mg·mL溶液，按照上述色谱条件进行测定，以浓度为横坐标()，峰面积值为纵坐标()，绘制标准曲线。

精密度试验 取薯蓣皂苷元对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积并计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值。

稳定性试验 取同一供试品溶液(Q4)，分别在溶液制备后的0、2、4、6、8、10、12 h测定，记录峰面积并计算RSD值。

重复性试验 精密称定同一份样品(Q4)6份，制成供试品溶液，记录峰面积并计算RSD值。

加样回收率试验 取已知含量的样品(Q4)6份2.5 g，精密称定，按待测成分在原药材中的含有量，加入等量的对照品溶液，制成供试品溶液进行测定，计算加样回收率和RSD值。

含量测定 精密吸取各产地供试品和对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件进行测定。

1.2.5.2 白藜芦醇含量测定(王光忠等，2006；孙兢喆，2015)

色谱条件 ZORBAX SB-C色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(40∶60)为流动相，流速为0.8 mL·min，柱温为30 ℃，检测波长为303 nm。

对照品溶液的制备 取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.260 mg·mL白藜芦醇对照品溶液。

供试品溶液的制备 取不同产地药材粉末1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称重，超声(100 W，40 kHz)40 min后，冷却至室温，补足重量，滤过，挥干，加甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

线性关系考察 取白藜芦醇对照品适量，精密称定，配制浓度为6.375、12.75、25.5、51、102、255 μg·mL溶液，按照上述色谱条件进行测定，以浓度为横坐标()，峰面积值为纵坐标()，绘制标准曲线。

精密度试验 取白藜芦醇对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD值。

稳定性试验 取同一供试品溶液(Q4)，分别在溶液制备后的0、2、4、6、8、10、12 h进行测定，记录峰面积并计算RSD值。

重复性试验 精密称定同一样品(Q4)6份，制成供试品溶液，记录峰面积并计算RSD值。

加样回收率试验 取已知含量的样品(Q4)6份0.5 g，精密称定，按待测成分在原药材中的含有量，加入等量的对照品溶液，制成供试品溶液进行测定，计算加样回收率和RSD值。

含量测定 精密吸取各产地供试品溶液和对照品溶液10 μL，按照上述色谱条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 性状鉴别

鞘柄菝葜根茎呈“短结节状”、深褐色、断面呈黄白色，在日光下可见小亮点；不定根较多，着生处隆起，基部膨大呈圆锥状，表面灰褐色，外皮常脱落，脱落处为深褐色，直径1～2 mm。质坚硬，难折断(图1)。

图 1 鞘柄菝葜根茎及横断面图Fig. 1 Rhizome and cross section of Smilax stans

2.2 显微鉴别

2.2.1 粉末特征 光学显微镜下，淀粉粒众多，多为单粒，类球形或椭圆形，脐点多呈飞鸟状、裂缝状、人字状、三叉状、星状或点状，复粒多由2～4分粒组成，层纹不明显，直径7～55 μm(图：2 a)；石细胞红棕色，呈不规则形，多单个散在，壁厚，孔沟和胞腔明显，直径32～106 μm(图：2 b)。纤维有两种类型：(1)短梭形纤维，淡黄色，壁厚，孔沟明显，胞腔较大(图：2 c)；(2)长柱形纤维，淡黄色或红褐色，其中淡黄色纤维，壁增厚，孔沟和胞腔明显，红褐色纤维，次生壁极度增厚，胞腔不明显，直径20～80 μm(图2：d，e)。导管多为梯纹，偶见网纹，直径13～39 μm(图2：f，g)。木化薄壁细胞偶见，不规则形，其内含有较多的淀粉粒(图2：h)。木纤维偶见(图2：i)。草酸钙针晶成束，偶见嵌入粘液细胞中(图2：j)。偏光显微镜下淀粉粒、石细胞、纤维、导管、木化薄壁细胞、木纤维和草酸钙针晶等具有偏光现象。淀粉粒呈黑“十”字状，脐点多偏向一侧，少数位于中央，边缘白色圆环明显；石细胞壁呈亮黄色；淡黄色短梭形纤维，其壁呈亮蓝白色；淡黄色长柱形纤维，其壁呈蓝白色；红褐色长柱形纤维，其壁呈亮红棕色； 网纹导管的管腔呈蓝白色、梯纹导管的管腔呈亮蓝白色；木化薄壁细胞壁及其内含的淀粉粒呈亮蓝白色；木纤维壁呈蓝白色；草酸钙针晶呈多彩色。

a. 淀粉粒; b. 石细胞; c,d,e. 纤维; f. 网纹导管; g. 梯纹导管; h. 木化薄壁细胞; i. 木纤维; j. 草酸钙针晶(1, 3列: 光学显微镜; 2, 4列: 偏光显微镜)a. Starch granules; b. Sclerotic cell; c, d, e. Fiber; f. Reticulate vessel; g. Idder vessel; h. Lignified parenchyma cells; i. Wood fiber; j. Needle-like calcium oxalate crystals(1, 3 row: Optical microscope; 2, 4 row: Polarizing microscope).图 2 鞘柄菝葜粉末特征图(×400)Fig. 2 Powder microphotoes of Smilax stans(×400)

2.2.2 根茎及不定根横切面特征 根茎横切面特征：光学显微镜下可见最外层木栓组织由2～3层红褐色木质化细胞组成，易脱落(图3：1)；下皮层为1层红棕色的厚壁细胞；皮层较广，由7～8层薄壁细胞构成，内皮层由1层黄色的厚壁细胞组成(图3：2，3，4)，内皮层以内有约十层径向排列的薄壁细胞；维管束为有限外韧型(图3：5)；红棕色的分泌细胞分布于整个根茎横切面(图3：8)。偏光显微镜下，下皮层厚壁细胞呈亮红棕色，皮层呈蓝白色，内皮层呈亮黄色；内皮层以内的薄壁细胞壁呈蓝白色；维管束鞘呈亮蓝白色。

A. 光学显微镜; B. 偏光显微镜; a. ×50; b. ×100; c. ×200; 1. 木栓组织; 2. 下皮层; 3. 皮层; 4. 内皮层; 5. 维管束; 6. 维管束鞘; 7. 木质部; 8. 韧皮部; 9. 分泌细胞。A. Optical microscope; B. Polarizing microscope; a. ×50; b. ×100; c. ×200; 1. Cork tissue; 2. Hypodermis; 3. Cortex; 4. Endodermis; 5. Vascular bundles; 6. Vascular bundle sheath; 7. Xylem; 8. Phloem; 9. Secretory cells.图 3 鞘柄菝葜根茎横切面特征图Fig. 3 Transection microphotoes of rhizome cross section of Smilax stans

不定根横切面特征：皮层较广，约占整个横切面的1/2(图4：1)；内皮层由1列马蹄形增厚的石细胞组成且排列成环(图4：2)；中柱鞘由5～7层厚壁细胞组成(图4：3)；辐射型维管束，木质部导管由1个大导管和8～9个小导管径向排列成环状(图4：5)；髓部约占横切面的1/5，且含有少数分泌细胞(图4：4)。偏光镜下内皮层呈亮黄色；中柱鞘细胞壁呈亮蓝白色；髓部的薄壁细胞壁呈蓝白色，其余组织无偏光现象。

A. 光学显微镜; B. 偏光显微镜; a. ×100; b. ×200; 1. 内皮层; 2. 中柱鞘; 3. 髓; 4. 分泌细胞; 5. 木质部; 6. 韧皮部。A. Optical microscope; B. Polarizing microscope; a. ×100; b. ×200; 1. Endodermis; 2. Pericycle; 3. Pith; 4. Secretory cells; 5. Xylem; 6. Phloem.图 4 鞘柄菝葜不定根横切面特征图Fig. 4 Transection microphotoes of adventitious roots of Smilax stans

2.3 薄层鉴别

供试品色谱中，在与薯蓣皂苷元色谱相应位置上，显相同蓝色荧光斑点，在与白藜芦醇色谱相应位置上，显相同亮蓝色荧光斑点见图5。

2.4 检查

不同产地鞘柄菝葜样品水分含量为3.72%～7.91%，总灰分含量为1.54%～4.74%，醇溶性浸出物含量为5.08%～7.31%，结果见表2。

表 2 不同产地鞘柄菝葜水分、总灰分、醇浸出物含量Table 2 Water, total ash and alcohol soluble extract contents of Smilax stans from different habitats

2.5 方法学考察及样品含量测定结果

2.5.1 薯蓣皂苷元

线性关系考察 薯蓣皂苷元对照品在0.10～0.70 mg·mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为=2 3843-27795，=0.999 7。

精密度试验 测得6次对照品溶液的RSD值为1.350%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验 12 h内同一供试品溶液(Q4)的RSD值为1.67%，说明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

重复性试验 6份供试品溶液中薯蓣皂苷元RSD值为0.44%，说明该方法具有良好的重复性。

加样回收率试验 6份样品的平均加样回收率为93.32%， RSD值为2.69%，表明该方法的准确度良好，具体结果见表3。

表 3 薯蓣皂苷元加样回收率试验结果Table 3 Results of added samples recovery test of diosgenin

薯蓣皂苷元含量测定 各产地供试品溶液和薯蓣皂苷元对照品HPLC色谱图见图6，含量测定结果见表5。

2.5.2 白藜芦醇

线性关系考察 白藜芦醇对照品在6.375～255 μg·mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为=100 264-157 654，相关系数=0999。

精密度试验 测得6次对照品溶液的RSD值为1.02%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验 12 h内同一供试品溶液(Q4)的RSD值为1.42%，说明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

重复性试验 6份供试品溶液中白藜芦醇RSD值为1.97%，说明该方法具有良好的重复性。

加样回收率试验 6份样品的平均加样回收率为96.45%，RSD为2.94%，表明该方法的准确度良好，具体结果见表4。

表 4 白藜芦醇加样回收率试验结果Table 4 Results of added samples recovery test of resveratrol

白藜芦醇含量测定 各产地供试品溶液和白藜芦醇对照品的HPLC色谱图见图7，含量测定结果见表5。

表 5 不同产地鞘柄菝葜薯蓣皂苷元和白藜芦醇含量Table 5 Contents of diosgenin and resveratrol in Smilax stans from different habitats

3 讨论与结论

本研究利用性状鉴别、显微鉴别对不同产地的鞘柄菝葜的入药部位“根及根茎”进行了系统的生药学研究，发现鞘柄菝葜根及根茎横切面显微特性突出：内皮层为1层黄色的厚壁细胞，红棕色的分泌细胞分布于整个横切面；不定根内皮层由1列马蹄形增厚的亮黄色石细胞组成且排列成环。粉末特征明显：石细胞红褐色、纤维为淡黄色短梭形纤维，淡黄色或红褐色长柱形纤维、导管为梯纹导管和网纹导管。以上特征可作为鞘柄菝葜药材及其同属混淆品区分的主要依据。同时，初步起草了鞘柄菝葜药材的质量标准，规定其性状与显微特征相符，薄层色谱鉴别斑点清晰，建议鞘柄菝葜药材水分不得超过9.0%，总灰分不得超过7.0%，醇溶性浸出物不得少于3.0%。本品按干燥品计算，含薯蓣皂苷元(CHO)含量不得少于0.015%，白藜芦醇(CHO)含量不得少于0.012%。

鞘柄菝葜为菝葜属“土茯苓”组植物，李官政等(2017)指出“中柱鞘狭窄”为该组植物不定根显微结构的共性，但是其对于“狭窄”的界定范围不明确，本研究发现鞘柄菝葜的中柱鞘为5～7层，但杜素兰等(2007)发现为7～9层。此外，前人报道同组植物“土茯苓”、小叶菝葜()、无刺菝葜()与西南菝葜()中柱鞘分别为4～8层、 3～5层、 5～12层、1～6层(陈代贤等，2003)，故笔者认为有关“中柱鞘狭窄”的这一观点有待探讨。同时，本研究发现鞘柄菝葜不定根中的“中柱鞘细胞”由木化的厚壁细胞组成，在偏振光下更为明显， 该特征与李官政等(2017)结论相悖，他认为鞘柄菝葜的中柱鞘由薄壁细胞组成，但本研究与杜素兰等(2007)报道一致，故认为木化的“厚壁细胞”是鞘柄菝葜不定根显微结构的一个主要特征。

A. 对照品溶液； B. 供试品溶液； 1. 薯蓣皂苷元。A. Reference substance solution; B. Smilax stans substance solution; 1. Diosgenin.图 6 薯蓣皂苷元对照品溶液与样品HPLC色谱图Fig. 6 HPLC chromatograms of diosgenin reference substance solution and sample

A. 对照品溶液； B. 供试品溶液； 1. 白藜芦醇。A. Reference substance solution; B. Smilax stans substance solution; 1. Resveratrol.图 7 白藜芦醇对照品溶液与样品HPLC色谱图Fig. 7 HPLC chromatograms of resveratrol reference substance solution and sample

本次研究所采集的样品具有较好的代表性，结果可全面有效地控制鞘柄菝葜药材质量，为其资源开发利用及临床正确用药奠定了基础，同时为菝葜同属中药材的质量标准研究提供思路与方法。