西藏大花红景天RcCATs与RcSODs基因克隆及功能分析

王宏鹏， 李一丹， 滕彦娇， 陈成彬， 张力鹏

(南开大学 生命科学学院，天津 300071)

大花红景天()是一种多年生草本植物，为景天科(Crassulaceae)红景天属()，主要分布于我国的青藏高原及其毗邻一带，包括西藏、云南和四川等地。中国药典记载大花红景天干燥根及根茎中含有多种活性成分，如红景天苷、酪醇及其衍生物，具有益气活血，通脉平喘的功能。现代生物医学研究证明，大花红景天根部浸出液能够保护神经，治疗抑郁、焦虑和癌症等多种疾病(Qu et al., 2012; Yuan et al., 2020)。但是，因其常伴有寒冷、低氧、强紫外照射等环境特点，主要分布于海拔3 500 ～5 000 m的山坡草地和大块石灰岩的缝隙中，生长环境较为严酷，使得大花红景天的采集和研究应用都十分困难(Fu et al., 2017)。目前，分子生物学研究多集中于大花红景天活性成分及其种质资源多样性研究，关于其生境适应性的分子机制，尚缺乏丰富的报道(Ma et al., 2007; Gyorgy et al., 2009)。

为了进一步研究和基因家族的功能，本研究以西藏大花红景天为材料，对ROS途径中的CAT和SOD基因家族成员进行克隆，基于在线软件和实时定量PCR对其生物信息学和特异性表达进行分析，并构建和1的酵母表达载体与酵母双杂交诱饵载体，分别进行酵母胁迫分析和筛选拟南芥酵母文库中的互作蛋白，以揭示西藏大花红景天对其高原恶劣环境适应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

研究材料为西藏大花红景天，于2015年7月采集自西藏地区米拉山山脉(海拔4 868.4 m、92.34° E、29.78° N)。经南开大学宋文芹教授鉴定为景天科药用植物大花红景天。部分材料经液氮速冻后保存于-80 ℃；其余材料以叶片为外植体进行组织培养获得无菌再生苗并进行后续实验。

1.2 实验方法

1.2.1 基因序列扩增、和基因序列来源于本实验室已完成的转录组数据库，基于拼接的unigene注释信息，分别以CAT和SOD为关键词对数据库进行检索，获得、和序列，然后根据所获得的基因序列设计特异性引物扩增全长，以大花红景天叶片cDNA为模板进行PCR反应，用PCR产物纯化试剂盒纯化后与pMD19-T vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行筛选，经菌液PCR和电泳检测后，挑选阳性克隆送上海生工测序。

1.2.2 总RNA提取与cDNA第一条链的合成 总RNA提取依照改良CTAB-异丙醇法进行(张力鹏等, 2017)。利用可见光分光光度计NanoDrop 1 000检测RNA的纯度和浓度，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。cDNA第一条的合成利用反转录酶M-MLV(Takara, Japan)，采用50 μL体系，反转录总RNA量为5 μg RNA。将反转产物用无菌dd HO稀释10倍后-20 ℃保存。

1.2.3 生物信息学分析 通过生物信息学在线网站对获得的、和基因氨基酸序列进行分析。利用Blastx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastx)进行序列验证；利用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)获得编码框；利用BlastP寻找同源基因(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)；利用DNAMAN计算、和与各自同源基因的同源性比值；利用ProtComp分析基因的亚细胞位置(http://linux1.softberry.com/)；利用TMHMM Server, v. 2.0分析基因的跨膜结构域有无(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；利用ExPASy预测蛋白质理化性质(https://web.expasy.org/protparam/) (张世鑫等, 2021; 解盛等, 2021)。

1.2.4 基因表达分析 组织特异性表达分析，采用同一株组培苗的根、茎、叶三个器官。非生物胁迫采用低温诱导，将处于同一生长时期的组培苗浸于冰水混合物中黑暗胁迫处理0、3、7 d。植物激素脱落酸(ABA)诱导，将同一生长时期的组培苗浸于含有50 μmol·LABA的MS液体培养基中，黑暗处理6、24、36 h，每个处理均设3个生物学重复。胁迫处理后，所有材料均经无菌水洗净并擦干后于液氮速冻，-80 ℃超低温保存。胁迫处理材料的叶片用于提取总RNA(张力鹏等, 2019)。

1.2.5 实时定量PCR 采用Bio-Rad公司荧光定量PCR仪iQ5进行qRT-PCR，检测目的基因在不同组织和不同胁迫条件下表达水平。反应体系为20 μL，包含10 μL SYBRGreen(Takara, Japan)，1 μL cDNA，0.5 μL上下游引物。以为内参基因，每个样品均采用三次生物学重复(Zhang et al., 2018)。

1.2.6 酵母表达载体构建和胁迫分析 利用无缝克隆法构建大花红景天和1的pYES2.0表达载体，大肠杆菌阳性克隆经菌液PCR和Sanger测序验证。将空载质粒、重组载体质粒按照LiTE/PEG法转入酿酒酵母INVSCI中。分别取INVSCI(pYES2.0、pYES2.0-、pYES2.0-1)单克隆于20 mL含2%葡萄糖的SC/-Ura液体培养基中，30 ℃/180 r·min培养至OD600位于0.5～0.8之间。收集菌体重悬于含2%半乳糖的SC/-Ura液体培养基中，调整OD600=2.0，30 ℃/180 r·min诱导24 h。将诱导后的阳性菌株按照10倍梯度稀释，取6 μL分别滴于不同YPDA平板中进行胁迫处理。胁迫条件为热胁迫(37 ℃处理1 d)、冷胁迫(-20 ℃处理6 h)、过氧化氢胁迫(YPDA平板中加入0.8、1.6、3.2 mmol·LHO)、盐胁迫(YPDA平板中加入200、400、600 mmol·LNaCl)、重金属和碱胁迫(平板中加入5、10 mmol·LCoCl或20 mmol·LNaCO)。将上述平板倒置于30 ℃培养箱中培养3 d后拍照(Wang et al., 2008)。

1.2.7和1自激活鉴定与互作蛋白筛选 酵母双杂交筛选拟南芥文库依Clontech公司Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual说明书进行。构建和1基因的诱饵载体，通过LiTE/PEG法转化Y2H Gold菌株；经菌液PCR验证阳性菌并进行自激活和毒性验证，以排除基因本身对杂交结果的影响；进行文库筛选，将诱饵载体与文库混合后涂布于SD/-Trp-Leu-His+β-gal培养基进行初筛，挑选蓝斑菌落摇菌提取质粒；利用T7/3’AD进行扩增和测序，根据测序结果确定基因；将比对后的阳性克隆，正对照pGBKT7-53+pGADT7-T，负对照pGBKT7-(1)+pGADT7分别滴于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His和SD/-Trp-Leu+β-gal培养基，30 ℃培养3 d后拍照(Zhang et al., 2018)。

2 结果与分析

2.1 大花红景天RcCATs和RcSODs基因的鉴定与克隆

因大花红景天没有参考基因组信息，同时NCBI网站公布的有关红景天属基因序列多为DNA条形码。因此，为解决其基因序列的缺乏，本实验室对西藏大花红景天进行转录组测序。通过拼接技术获得unigenes序列并进行功能注释。最终得到2条编码过氧化氢酶CAT的基因分别命名为和1，得到3条编码超氧化物歧化酶SOD的基因分别命名为1、2、3，1条编码超氧化物歧化酶的铜伴侣的基因。

根据各基因unigenes序列分别设计引物，以大花红景天叶片cDNA为模板进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。由图1可知，和1基因长度均为1 479 bp，编码为492个氨基酸，分子量稍有不同，RcCAT为56 701.04 Da，RcCAT1为56 818.29 Da。1和2基因编码Cu/Zn SOD，核苷酸大小为471/669 bp，编码156/222个氨基酸，分子量为16 070.12/21 870.7 Da；3基因编码Fe SOD，核苷酸数量为804 bp，可编码267个氨基酸，蛋白质分子量为30 816.31 Da。基因大小为1 008 bp，编码335个氨基酸。

图 1 大花红景天CAT、SOD、CCS基因PCR扩增电泳图Fig. 1 PCR amplification electrophoresis result of CAT, SOD, CCS genes of Rhodiola crenulata

2.2 大花红景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因生物信息学分析

对大花红景天、和基因的氨基酸序列进行分析，通过在线BlastP比对，获得NCBI数据库中的同源基因，利用DNAMAN计算各自基因与其同源基因的序列相似度，并利用多个在线网站基于其氨基酸序列进行分析。结果显示，6个基因与其同源基因的序列一致性在60%以上，基因最高(95.51%)，基因最低(66.37%)， 各自同源基因均为双子叶植物， 且尚未下载到景天科红景天属的相关序列。蛋白质理化性质分析结果显示1和3蛋白质的等电点高于7.0，其余4个基因均为酸性蛋白质，其中的等电点最低，为5.7。脂溶指数均在70%以上，其中1和2较高，分别为91.86和88.93，说明其为明显的脂溶性蛋白。总平均亲水性除2(0.085)外，其他均为负值，说明其具有一定的亲水性。此外，对跨膜结构域和其发挥生物学功能的主要亚细胞位置进行分析，结果显示6个基因均无跨膜结构域，定位于过氧化物酶体，1和2定位于细胞质，3和定位于线粒体。蛋白激酶磷酸化位点预测结果显示6个基因均具有可磷酸化氨基酸位点，说明其可能受到蛋白磷酸激酶的调控(表1)。利用MEGA7.0构建和的N-J进化树，结果显示基因与棉花()的遗传距离最近，而1与所列物种的CAT基因遗传距离较远。1与猕猴桃()最近，2与甜瓜()最近，3与西葫萝()、苦瓜()遗传距离最近(图2)。

表 1 大花红景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因序列信息Table 1 RcCATs, RcSODs and RcCCS gene sequence information in Rhodiola crenulata

图 2 RcCATs和RcSODs基因的N-J进化树Fig. 2 N-J phylogentic tree of RcCATs and RcSODs

2.3 RcCATs、RcSODs和RcCCS基因组织特异性表达模式

因不同基因发挥其分子功能的部位不同，基因常具有组织器官表达特异性。利用实时定量PCR方法检测、和基因的mRNA在三个组织部位(根、茎、叶)的表达水平，可进一步了解各基因在大花红景天生长周期内所扮演的角色。结果显示基因的两个成员在不同组织的表达水平差异很大，相比于根组织，在叶片中表达量最高呈2.5倍的显著差异，茎中的表达稍低，约为0.6左右；而1在叶片和茎中表达均较低，仅为根中的1/5。基因的表达模式十分相似，即在根与茎中表达量相近而远低于叶中的表达量，如1在叶片中表达量是根茎中的2倍，2可达4倍左右；3基因在叶片中超表达是根的6.7倍，茎的3.7倍。基因的表达模式与2相似，在叶片中高表达是根/茎组织的3.5倍左右(图3)。

A. 根; B. 叶; C. 茎。*表示显著性差异(P<0.05); **表示极显著性差异(P<0.01)。下同。A. Root; B. Leaf; C. Stem. * indicates significant differences (P<0.05); ** indicates extremely significant differences (P<0.01). The same below.图 3 大花红景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因组织特异性表达模式图Fig. 3 Expression pattern graph of RcCATs, RcSODs and RcCCS tissue-specificity

2.4 冷胁迫与植物激素ABA诱导下RcCATs、RcSODs和RcCCS基因表达模式

大花红景天生长的环境恶劣，主要表现为温度较低，而低温会降低呼吸作用和光合作用速率，同时诱发产生大量活性氧，以阻碍植物的生长发育。因此对大花红景天组培苗进行了低温胁迫处理，以进一步分析、和基因在低温诱导下的表达模式变化。结果显示基因随着胁迫时间的延长表现出明显的上调趋势，尤其是的表达量较对照组提高2倍左右；相反3个基因的表达量呈下降趋势，仅2在胁迫第7天时有微弱的上调趋势，且与基因的表达模式一致。

植物内源激素脱落酸(abscisic acid，ABA)作为一种广泛应答胁迫的信号，在调节植物体内平衡以及提高胁迫耐受性方面发挥重要的作用，因此本研究绘制了大花红景天、和基因在不同ABA处理时间下的表达谱。结果显示的两个成员表达变化完全不同，在胁迫24 h时下调表达相比于对照组下降5倍以上；1上调表达为对照组的6倍左右。基因的3个成员中，1随ABA胁迫时间的延长而下调表达仅为对照组的40%，2和3表现出先下调后上调的趋势。此外，基因的表达模式与2一致，即24 h下调表达，36 h上调表达(图4)。

图 4 大花红景天RcCATs、RcSODs和RcCCS基因响应低温和ABA胁迫表达水平Fig. 4 Expression levels of RcCATs, RcSODs and RcCCS genes under cold and ABA treatment conditions by qRT-PCR

2.5 RcCAT和RcSOD1的酵母异源表达与胁迫分析

为进一步分析和基因在调节大花红景天应对高原恶劣环境时的生理意义，我们分别构建了和1的pYES2.0重组载体，并转入酿酒酵母菌株INVSCI中(图5)。由图5可知，在6种胁迫下，转pYSE2.0空载的酵母菌株生长的数量、菌斑大小和生命能力均不如和1基因的阳性菌株。低温处理6 h后，空载菌株已失去了生活能力，而对和1菌株影响较小；过氧化氢能够明显抑制酵母生长，空载菌株在1.6、3.2 mol·L时已基本失去了细胞活性，但异源表达和1的菌株仍可在细胞浓度较高时具备一定的生命能力；对于不同浓度的盐胁迫而言，对空载菌株的影响非常大，而对和1菌株影响较小；同样，重金属和NaCO胁迫也对阳性菌株影响较低。

图 5 过表达RcCAT和RcSOD1基因的酵母非生物胁迫诱导分析Fig. 5 Yeast abiotic stress induction analysis of RcCAT and RcSOD1 overexpressions

2.6 RcCAT和RcSOD1互作蛋白的筛选

为了进一步研究和基因的功能，分别对和1基因进行克隆，并筛选拟南芥文库。首先验证其自激活活性和细胞毒性。如图6所示，转化pGBKT7-和pGBKT7-1的酵母细胞均在SD/-Trp培养基上能正常生长，但在SD/-Trp-His培养基上无法生长，负对照pGBKT7在SD/-Trp-His培养基上无法生长，正对照在SD/-Trp-His培养基上正常生长，表明RcCAT和RcSOD1蛋白均没有自主激活活性和细胞毒性。

图 6 RcCAT和RcSOD1基因酵母自激活和毒性验证Fig. 6 Transcription activity and toxicity detection of RcCAT and RcSOD1

通过拟南芥酵母文库筛选和点对点滴板验证，筛选到了4个与互作明显的基因，分别为(AT3G19860)、2(AT2G23070)、4(AT5G50750)和1(AT3G08850)(图7)；3个与1互作明显的基因，分别是(AT5G11890)、2(AT1G52030)和8(AT4G00660)(图8)。拟南芥文库数据库收录的基因功能描述见表2。

图 7 RcCAT互作蛋白验证Fig. 7 Validation of interaction proteins for RcCAT

图 8 RcSOD1互作蛋白验证Fig. 8 Validation of interaction proteins for RcSOD1

表 2 RcCAT和RcSOD1基因互作基因信息Table 2 Interaction genes function information of RcCAT and RcSOD1

3 讨论与结论

活性氧作为植物体内源分子，一方面在正常条件下可由光合作用和呼吸作用中电子传递链产生；另一方面当外界环境发生改变时会引起生物膜系统或电子传递链的损伤，从而诱发产生大量ROS，对细胞造成氧化损伤，因此ROS作为信号分子可直接参与植物对胁迫的应答。本研究中，共分离了ROS清除途径中的2条CAT酶基因、3条SOD酶基因和1条SOD铜伴侣基因。组织表达特异性分析和亚细胞定位预测结果表明基因主要在叶片中大量表达，亚细胞位置定位于过氧化物酶体，并受到低温胁迫诱导大量表达，这与羊茅1基因亚细胞定位于过氧化物酶体，其在冷处理的叶片中被显著诱导(杨文龙等, 2006)以及表达小麦CAT基因的水稻提高了对低温胁迫的应答(Matsumura et al., 2002)等的研究结果一致。同时，FaCAT1是一种ⅰ型过氧化氢酶，有报道称ⅰ型过氧化氢酶在叶片中高度表达并参与清除光呼吸中HO的去除(Willekens et al., 1995)。因此，基因可能共同参与了大花红景天光呼吸作用和对外界胁迫的应答。此外，2和基因在组织表达特异性、低温或ABA胁迫诱导时的表达模式十分相近，推测可能特异性将铜离子传递给2，将其激活生成有活性的酶分子(Yamasaki et al., 2009)。经同源序列比对，1和2虽均编码Cu/Zn SOD，3编码Fe SOD，但1在低温下的表达模式与3相似，在ABA诱导下的表达模式与2有所差异。刘家林等人报道的水稻基因也存在类似的情况，即同一类型基因在同一逆境下的表达量也有所不同(刘家林等, 2018)，说明在大花红景天体内均可将超氧阴离子转变为过氧化氢，但存在功能上的冗余和分歧。

通过构建表达载体pYES2.0，将和1基因异源过表达于酿酒酵母菌株INVSCI中，并以空载质粒作为对照，分析其在不同处理下细胞生长的水平，结果可见和1均可应对冷、热、盐、碱、HO、重金属等胁迫压力，班巧英等(2008)将紫杆柽柳MnSOD基因转入酵母，也提高了酵母抵抗盐、碱和紫外线胁迫的能力。因此，推测两个基因在大花红景天体内可能直接参与ROS分子的清除并协助其应对复杂的外界环境，同时，进一步证实了CAT和SOD基因能够广泛参与植物的非生物胁迫以维持体内ROS含量的平衡(陈金峰等, 2008; 刘家林等, 2018)。此外，酵母双杂交也筛选到基因的互作基因如121，该基因为bHLH类转录因子，在铁元素缺乏时可引起磷酸化，继而诱导HLH38/39/100/101基因表达，这些转录因子反过来与FIT二聚化驱动IRT1和FRO2的基因的转录以增加铁的摄取(Lei et al., 2020)。另一互作基因2为质体酪蛋白激酶2，是叶绿体基质蛋白特异性Ser/Thr磷酸化酶，其活性可受到氧化还原信号调控，并可参与ABA调控拟南芥种子的萌发和幼苗的生长(Wang et al., 2014; Kim et al., 2016)。说明或1也可通过蛋白质-蛋白质相互作用调节植物的生长代谢网络，但其调控机理仍需进一步研究。

大花红景天的生长发育与抗逆基因的表达密切相关。本研究已对大花红景天ROS途径中2个关键基因和进行分离和分析。分析表明，大花红景天的和基因家族在进化过程中发生了分化，并广泛参与调控其生长发育、胁迫响应等代谢途径。这种发现有利于了解大花红景天应对高原恶劣环境的适应性，在随后的研究中借助转基因技术对其生境适应性机制进行深入研究，有望实现大花红景天的人工引种驯化和规模化、产业化种植，同时提高研究人员对高原植物生长繁衍的认知。