机械修剪疏果提升椪柑果实品质的作用及机制

石莹，曾译可，陈思怡，李国敬，黄先彪，李善军，李春龙，谢宗周，刘继红

1.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070；2.湖北省当阳市特产技术推广中心，当阳 444100；3.华中农业大学工学院，武汉 430070；4.湖南省邵阳市农业科学院，邵阳422002

柑橘是我国南方最重要的经济作物，柑橘果实不仅可以鲜食，还是重要的药用和食品工业原料，在国际农产品贸易中具有不可忽视的地位。随着消费水平的提高，生产优质大果成为栽培过程中的重要目标，而常规管理的果园一般花量大、树体养分消耗多，通过人为调节进行高效的花果管理才能连年优质稳产。美国早在20 世纪70 年代开始研究柑橘的化学疏花疏果［1］，我国生产实践中主要采用人工疏果。张长梅［2］认为中国柑橘产业独特的竞争优势就是生产成本低，但随着农村劳动力外流和老龄化加剧，柑橘生产普遍出现用工成本上升、果园管理不到位等现象［3］，人工疏果不再适应当前劳动力短缺的现状［4］。我国农业生产逐渐开始进入以机械生产为主的时代［5］，王刘坤等［6］建议我国柑橘产业要结合当地的经济发展情况加大果园机械化技术的研发和推广力度，率先在劳动密集环节实现突破，提高生产效率。柑橘机械修剪在国外应用较多，利用整株几何修剪机、单枝修剪机［7］对树体枝梢进行整理，从而调控树体高度、促进内膛进光。

湖北省是我国主要的柑橘优势产区之一，椪柑因其易剥皮、果肉脆等特点成为重要发展的宽皮橘类型。但受经济发展状况、产业布局合理性以及地理条件的限制，我国柑橘面积和产量连续增加的同时生产效率没有得到相应提升［6］。椪柑产业发展遇到的瓶颈问题是坐果量大导致果实小和品质参差不齐，因此，增加大果比例和提升果实品质是促进椪柑产业发展的重要手段。然而，利用机械修剪进行柑橘疏果尚无报道，机械修剪能否实现疏果和提质、对产量和果实品质的影响有待验证，修剪方案也有待进一步优化和提升。鉴于此，本研究以‘鄂柑1号’椪柑植株为试材，利用华中农业大学工学院研发的背负式修枝机进行机械修剪疏果，探究机械修剪疏果处理后果实品质的变化，并基于糖酸代谢基因表达分析初步揭示其作用机制。

1 材料与方法

1.1 植物材料和处理

供试植物为湖北省当阳市半月镇龙台村凤凰山18 年生‘鄂柑1 号’椪柑（砧木为枳（Poncirus trifoliata）），树势中庸，树冠高度2.5 m，株距2.5 m，行距4.5 m，果园进行常规肥水管理和病虫害防治。

椪柑第2 次 生理落果结束后，2020 年7 月19 日（开花后88 d）进行机械修剪疏果。试验设2 个处理（每个处理各选3 行树）：处理1（机械修剪疏果，简称为MT）以行间方向与树冠滴水线的切点为起点，使用背负式修剪机将该切点往树干方向50 cm 内的所有枝条与果实一同疏除；处理2 不疏果，作为对照（CK）。修剪后，每个处理随机选3 棵树，每棵树随机选择15 个果实进行挂牌标记，每15 d 测量1 次果实横径和纵径；10 月7 日开始每15 d 采样1 次，在每棵植株同一高度上的4 个方向各随机采1 个果实，采样当天带回实验室测定生理指标，并分别取下囊瓣和果皮用液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱备用。12月25 日果实采收后对2 个处理的果实分别称质量、计算产量并统计采果数，所有时期取样完成后分析可溶性糖和有机酸含量，并分析糖酸代谢相关基因的表达水平。

1.2 测定项目与方法

1）果实大小及产量测定、外观品质分析。使用电子游标卡尺（精确到0.01 mm）测量果实横纵径；使用电子天平（精确到0.01 g）测定单果质量；使用电子测厚规测量果皮厚度；使用色彩色差仪（*cm-5，美能达，Japan）测量果面色泽参数L*、a*和b*；使用质构仪（*TA.XT.Plus，Stable micro systems，UK）测定硬度；使用机械分选线分级，对2 个处理的所有果实称质量、计算产量，并统计采果数。

2）可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和有机酸含量分析。可溶性固形物使用PAⅬ-1 手持折光测糖仪（Atago，Japan）测定；可滴定酸使用GMK-835F 水果酸度计（G-WON，South Korea）测定。采用气相色谱法［8］测定可溶性糖和有机酸含量，使用安捷伦GC-7890B 气相色谱仪，HP-5 色谱柱（5%-Phenyl-methyl polysiloxane.30 m×320 μm×0.25 μm），检测器温度300 ℃，载气（N2）流量45 mⅬ/min，燃气（H2）流量40 mⅬ/min，空气流量450 mⅬ/min。

3）总RNA 提取及荧光定量PCR。用PⅬANT pure通用植物总RNA 快速提取试剂盒（Aidlab公司）提取椪柑果肉总RNA。用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）去除基因组DNA 后合成cDNA，实时荧光定量PCR 采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（ABI，USA）检测基因表达量，方法参照说明书。采用QuantStudio 7 Flex system（Applied Biosystems，美国）荧光定量分析仪进行反应，基因的相对表达量采用2-ΔΔCT方法［9］计算。本研究用到的引物信息见表1。

表1 基因表达分析用的引物及序列Table 1 List of primers used for expression analyses of the genes in this study

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016 和SPSS 进行数据分析，采用ⅬSD进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 机械修剪疏果对果实外观品质的影响

花后88 d（7月19日）进行机械修剪疏果，疏果当天CK 的果实横径、果实纵径与MT 处理组没有显著差异，处理15 d 后MT 显著高于CK（图1A、B），机械修剪疏果显著增大了果实的横径和纵径。机械修剪疏果80 d时（花后168 d）开始采样测定单果质量和果实品质，CK 的单果质量平均值为93.62 g，而MT 的单果质量平均值达到了109.34 g，极显著高于CK，花后247 d 果实采收时MT 的平均单果质量相对CK 提高了25.04%（图1D）。果实硬度在成熟过程中逐渐降低，MT 的硬度高于CK 且自花后168 d 开始差异极显著（图1E），机械修剪疏果显著提高了果实硬度。

在果皮着色方面，机械修剪疏果对果实的果皮色泽参数L*值没有显著影响（图2 A）；花后206 d 时MT 的平均果皮色泽参数a*值超过了CK 且在220 d时表现出显著差异，机械修剪疏果加快了果实的转色过程（图2 B）；果皮色泽参数b*值（黄蓝值）的变化情况与L*相似，二者之间没有显著差异（图2 C）；而在色泽饱和度方面，MT 的CCI（citrus color index）显著低于CK 直到花后206 d，机械修剪疏果延缓了果实CCI 的增加但不影响最后的着色（图2D）。

2.2 机械修剪疏果对果实内在品质的影响

椪柑果实可溶性固形物（total soluble solids，TSS）持续积累，花后191 d MT 的TSS 含量快速增加，花后206 d 开始显著高于CK，花后220 d 达到了11.57%，极显著高于CK的10.33%，二者之间保持显著差异直至采收（图3 A）。可滴定酸（titratable acids，TA）持续下降，CK 从2.19%降至0.6%，MT 从2.01%降至0.56%且各时期的平均值低于CK，花后206 d 差异显著（图3 B）。机械修剪疏果显著提高了椪柑果实的可溶性固形物含量，也一定程度上降低了可滴定酸含量。

花后206 d时MT的蔗糖含量达到了50.63 mg/g，显著高于CK 的39.62 mg/g，机械修剪疏果显著提高了椪柑果实的蔗糖含量（图4 A）；果糖的积累趋势与葡萄糖相似，没有受到机械修剪疏果的影响（图4 B、C）；柠檬酸和奎宁酸的含量持续降低，机械修剪疏果显著加快了柠檬酸和奎宁酸降解的速度（图4 D、F）；花后168 d 至花后247 d 苹果酸的含量稍有增加，花后206 d 开始MT 的苹果酸含量显著高于CK（图4 E），机械修剪疏果提高了苹果酸含量。

12月25日（花后247 d）采收果实，统计分析果实大小，发现机械修剪疏果处理组（MT）没有果径＜55 mm 的 果 实；55～60 mm 占 比2.81%，为CK 的6.59%；60～65 mm 占比12.39%，单株68 个，为CK的20.88%；65～70 mm 占比28.49%，单株156 个，为CK 的65.50%；70～75 mm 大果占比34.14%，单株187 个，为CK 的1.82 倍；＞75 mm 果实占比22.17%，单株122 个，为CK 的2.87 倍。测定12 月25 日采收果实的果皮厚度发现，MT 的平均果皮厚度为3.54 mm，与CK 的平均果皮厚度3.30 mm 没有显著差异，机械修剪疏果在不影响果皮厚度的情况下显著提升了大果比例（表2）。

表2 机械修剪疏果对椪柑果实大小及产量的影响Table 2 The effect of mechanical pruning-mediated fruit thinning on the size and yield of Ponkan fruit

2.3 机械修剪疏果对糖酸代谢相关基因表达水平的影响

果实品质分析结果表明机械修剪疏果提高了椪柑果实的蔗糖含量和可溶性固形物含量，降低了柠檬酸含量和可滴定酸含量。因此，我们首先验证MT和CK 果实中蔗糖代谢相关基因的表达水平。机械修剪疏果处理25 d 时CsSSs 在CK 中的表达水平显著高于MT，但此后机械修剪疏果果实中CsSSs 的相对表达量快速升高，且在处理50 d 后显著高于CK，其中CsSS4增加程度最高，高出同一时期CK 果实中表达水平的35 倍（图5 A）；CsSPSs 的表达水平变化情况与CsSSs相似（图5 B）。蔗糖合成相关基因的表达情况与MT 果实中蔗糖含量显著高于CK 果实的结果相符，且MT 和CK 果实之间蔗糖含量表现出显著差异的时期为花后206 d，而MT 果实中蔗糖合成相关基因显著上调的时间为花后191 d 至花后220 d期间，二者之间的变化时间也一致，表明机械修剪疏果可能通过上调CsSSs 和CsSPSs，尤其是CsSS4、CsSPS1、CsSPS3和CsSPS4的表达提高了椪柑果实的蔗糖含量。

同样，我们验证了MT 和CK 果实中柠檬酸代谢相关基因的表达水平。柠檬酸降解相关基因中，机械修剪疏果处理50 d 后CsACLα2 的表达水平在MT中显著升高而CsACLβ的表达水平显著降低（图6 A）；处理75 d 后，CsACO1在MT 中的相对表达量极显著高于CK，CsACO2和CsACO3的表达水平在机械修剪疏果处理50 d 后极显著高于CK（图6 B）；机械修剪疏果50 d 后CsNADP-IDH2/3在MT 中的表达水平快速升高显著高于CK，CsNADP-IDH1处理75 d 后在MT 果实中也显著高于CK（图6 C）。机械修剪显著上调了椪柑果实中柠檬酸降解相关基因的表达水平，上调时间大多为机械修剪疏果后50 d 或者75 d，这与MT 果实中柠檬酸含量显著低于CK 的结果相符，进一步证明了机械修剪疏果可能通过上调柠檬酸降解相关基因CsACOs 和CsNADP-IDHs，尤 其 是CsACO1、CsACO2和CsACO3以 及Cs-NADP-IDH1和CsNADP-IDH3的表达来降低椪柑果实中柠檬酸的含量。

3 讨论

本研究中机械修剪疏果处理显著提高了椪柑大果的分布频率和平均横径、纵径以及单果质量。可见机械疏花疏果、化学疏花疏果［13］、人工疏果［14］均能减小无效的养分消耗，降低果实之间的营养竞争，从而提高大果比例、提升果实品质，并改善树体的营养状况。前人研究发现，果实增大的同时果皮一般也相应增厚［15］，而本研究中MT 果实的果皮厚度相较CK没有显著差异，表现出优良的品质。

此外，机械修剪疏果还显著提高了果皮硬度，在蓝莓［16］、苹果［17］、温室油桃［18］中也得到了同样的结果，果实硬度对运输距离、货架期和经济效益有非常大的影响。通常认为果实组织中维持较高的钙水平可以保持果实的硬度，我们推测机械修剪疏果可能通过减小养分竞争来维持较高的钙水平，从而提高果实硬度、提升果实在贮藏和销售过程中的表现。在果皮色泽方面，机械修剪疏果加快了椪柑果实的着色，与邓永辉等［14］在云南早熟柑橘上的研究结论一致，我们推测果面着色的加快与机械修剪疏果减少了养分竞争、改善了树体光照、增加了果实的光合作用有关。此外，田梦瑶等［19］研究发现外源蔗糖处理可以通过维持相对较高的花色苷合成代谢相关酶的活性来促进桃果皮花色苷的合成，因此我们推测果皮着色的加快还可能受到蔗糖含量增加的影响。

本研究中机械修剪疏果提升了椪柑果实的内在品质，显著提高了TSS 含量、促进了蔗糖的积累。果实糖分运输和积累是一项复杂的过程。柑橘果实进入成熟期后糖分迅速积累［20］，机械修剪疏果通过减小养分竞争、改善树体光照增加了叶片光合产物向果实中的分配量；机械修剪疏果能够增强果实本身的光合作用，减少果皮对光合产物的竞争，直接或间接促进了汁囊中糖的积累；陈俊伟［21］提出蔗糖的运输具有携带信号的功能，植物通过对不同糖水平的响应来调节相关基因表达，从而将各种外部的环境因子（光、其他养分、生物及非生物胁迫）和内在的发育进程整合在一起，我们发现MT 果实中蔗糖合成相关基因CsSS2、CsSS3和CsSS4以及CsSPS1、CsSPS3和CsSPS4的表达水平显著上调。另外，糖对源库关系也起调控作用，蔗糖含量的增加意味着更高的糖分积累基础。

柑橘果实中的柠檬酸主要在汁胞细胞的线粒体中直接合成［22］，其含量受温度、水分、营养元素、光照等环境因素或栽培措施的影响［23］，如增强光照可促进柠檬酸的降解、水分胁迫可显著提高果实柠檬酸含量［24］。我们推测机械修剪疏果改善了光照条件，从而上调柠檬酸降解相关基因CsACLs、CsACOs 和CsNADP-IDHs 的表达水平，以此加快柠檬酸的降解，但果实感应环境信号、转录因子参与代谢途径调控的具体机制还有待进一步研究。

本研究中，机械修剪疏果可以显著提高椪柑的果实品质，但更重要的是在疏果效率和经济效益方面的提升。传统的手工疏果效率约为2棵/h，而机械修剪疏果处理效率可达16棵/h，本研究供试果园700株椪柑若全部采用手工疏果需要350 h，而机械修剪疏果只需43.75 h，大大提升了疏果效率、节省了人工。总体来看，机械修剪疏果能够在省时省力的前提下显著提升椪柑的果实品质、改善树体营养状况，增加果农的收益，可以在产区进行进一步的试验和推广。