陕北狗头红枣可溶性膳食纤维提取工艺优化及其理化特性与抗氧化活性研究

王虎玄， 赵天添， 王 聪， 张一凡， 朱亚南， 孙宏民

(陕西科技大学 食品科学与工程学院， 陕西 西安 710021))

0 引言

红枣(学名：red jujube)，鼠李科枣属植物，已有8 000多年栽培历史，在我国种植面积广、产量大.红枣在我国按栽培地理位置不同主要分为山东枣、山西枣、河北枣、陕西枣、新疆枣等.其中，陕西陕北地区狗头红枣不仅个大，肉厚，而且富含可溶糖、蛋白质、膳食纤维(DF)、维生素等营养物质，对人体健康具有多种保护作用而受到消费者喜爱[1].

DF被称为“第七营养素”，是一类人体胃肠道酶无法水解，但可被一些肠道菌群部分代谢和利用的植物性碳水化合物，主要包含植物胶、果胶、多糖、蜡质、纤维素、木质素等[2].DF分为水溶性(SDF)和非水溶性(IDF)两大类，SDF比IDF具有更高的生理活性功能，但其在自然界中的占比较低(不足10%).SDF可以降低胆固醇、排出重金属离子、调节血糖水平、改善肠道菌群以及预防心脑血管等慢性疾病的生理活性[3]；IDF主要加快大肠蠕动和排便以防止便秘，并可通过抑制肠道细菌代谢生成肠毒素以及稀释食物中有毒有害物质的途径预防直肠癌[4].

据文献报道，提取DF的方法主要分为物理法(如膜分离法、 超微粉碎法等)、化学法(如酸法、碱法)以及生物法(如微生物发酵法、 酶法等)等[5].由于酶法不仅对提取条件要求低，而且可高效、快速提取，提取过程无污染，以及能够较为完整保留提取物结构及活性等优势，已成为研究热点[6-7].酶法提取SDF的原理是通过酶促反应去除原料中非DF成分，主要是淀粉(α-淀粉酶、糖化酶等)、α-淀粉酶水解产物(糖化酶等)、蛋白质(木瓜蛋白酶等)等，并采用纤维素酶降低DF分子量，增加SDF含量，最后经乙醇沉淀得到SDF[8-9].与物理提取法相比，酶法具有能耗低、无需专用设备、提取成本低等优势；与化学提取法相比，酶法具有无污染、提取的DF纯度高以及结构及活性保留完整等优势；与微生物发酵法相比，酶法具有提取周期短、有利于大规模生产、提取工艺可控等优势[10-12].超声波处理操作简单，具有振动、空化以及热效应等特性，能够对原料组织细胞壁进行有效降解，并一定程度干扰聚合物多糖中化学键的稳定性，影响聚合物的形态和结构，加速活性物质的扩散和溶出[13].课题组前期研究发现相比于酶法和酶-化学法，超声波-酶耦合法可显著提高陕北狗头红枣SDF得率(未发表)，但具体工艺参数尚待优化.

目前，对红枣活性成分的研究多集中在黄酮、多酚、环核苷酸等方面，对SDF研究相对较少，尤其是陕北狗头红枣.红枣高品质SDF高效提取工艺的开发对提高陕北红枣资源综合利用率，延长红枣加工产业链，提高红枣加工附加值以及推进红枣SDF的产业化加工具有重要的意义，可为陕北红枣SDF制品高值化开发与应用奠定坚实理论基础.

基于此，本研究以陕北狗头红枣为原料，采用超声波-酶耦合法提取SDF，通过单因素试验及响应面设计系统优化SDF提取工艺，并对红枣SDF的理化性质、结构表征及抗氧化特性进行综合分析，以期为陕北狗头红枣SDF制备和产业化应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料

陕北狗头红枣，购买于陕西省西安市未央区西北农副产品中心市场.α-淀粉酶(50 U/mg)，木瓜蛋白酶(800 U /mg)，糖化酶(100 000 U/mg)，购自上海源叶生物科技有限公司.SDF标准品(CAS No.：68424-04-4，聚葡萄糖)，购自上海麦克林生化科技有限公司；浓盐酸、乙醚、氢氧化钠、95%乙醇均为分析纯，购自西安永屹化玻试剂有限公司.

1.1.2 主要仪器

HC-100T粉碎机，河城工贸有限公司；智能型电热恒温鼓风干燥箱，上海琅玕实验室设备有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，SHB型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52CS-1旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器设备有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KH2200DE型数控超声波，昆山禾创超声仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 红枣粉制备

红枣清洗并去核后，置于真空干燥箱内50 ℃干燥12 h，粉碎，过60目筛，再次50 ℃干燥6 h得到红枣粉，作为原料备用.

1.2.2 超声波-酶法提取红枣膳食纤维

红枣粉→加入乙醚(12 mL)→加入磷酸盐缓冲溶液(pH 6.0，10 mL)→控温超声(功率100 W，料温55 ℃,时间30 min)→加入α-淀粉酶(添加量200 U/g、温度60 ℃，料液pH 6.0，时间60 min)→调节pH→加入木瓜蛋白酶(添加量6 000 U/g，温度60 ℃，料液pH 6.0，时间60 min)→调节pH→加糖化酶(添加量2 000 U/g，温度50 ℃，料液pH 5.0，时间60 min)→离心取上清(4 000 r/min，10 min)→浓缩→4倍体积醇沉→离心→干燥→SDF.

SDF按照《GB 5009.88-2014食品中膳食纤维的测定》进行测定.红枣SDF得率计算公式如下：

SDF得率(%)=m/M×100

(1)

式(1)中：m为提取SDF粉末质量，g；M为红枣粉质量，g.

1.2.3 单因素实验

(1)超声处理的影响

按照1.2.2所述方法，分别探究不同超声功率(50、100、150、200、250 W)以及不同超声时间(10、20、30、40、50 min)对红枣SDF得率的影响.

(2) α-淀粉酶的影响

按照1.2.2所述方法，分别探究α-淀粉酶不同添加量(100、150、200、250、300 U/g)、不同酶解温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、不同酶解时间(30、60、90、120、150 min)以及不同酶解pH(4、5、6、7、8)对红枣SDF得率的影响.

(3) 糖化酶的影响

按照1.2.2所述方法，分别探究糖化酶不同添加量(1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 U/g)、不同酶解温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、不同酶解时间(30、60、90、120、150 min)以及不同酶解pH(4、5、6、7、8)对红枣SDF得率的影响.

(4) 木瓜蛋白酶的影响

按照1.2.2所述方法，分别探究木瓜蛋白酶不同添加量(4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g)、不同酶解温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、不同酶解时间(30、60、90、120、150 min)以及不同酶解pH(4、5、6、7、8)对红枣SDF得率的影响.

(5)纤维素酶的影响

按照1.2.2所述方法，分别探究纤维素酶不同添加量(400、800、1 200、1 600、1 800 U/g)、不同酶解温度(40、50、60、70、80 ℃)、不同酶解时间(30、60、90、120、150 min)以及不同酶解pH(4、5、6、7、8)对红枣SDF的影响.

1.2.4 响应面设计

以纤维素酶添加量(A)、纤维素酶酶解pH(B)、纤维素酶酶解温度(C)及超声功率(D)4因素，红枣SDF得率为响应值进行响应面优化.采用Design Expert 8.0软件设计4因素3水平试验.

1.2.5 理化性质测定

持水力、持油力、膨胀力、阳离子交换以及葡萄糖和胆固醇吸附试验参照张智等[14](2022)报道方法进行.

1.2.6 结构表征

(1)红外光谱测定

将SDF干样与溴化钾(1∶100)研磨混合后进行红外光谱扫描(波长范围 400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1).

(2)显微结构分析

将SDF干样进行必要预处理后进行扫描电镜观察[15]，并分析膳食纤维显微结构.

1.2.7 抗氧化活性分析

DPPH和ABTS自由基清除率测定参照王天等[8](2022)报道方法进行.

1.2.8 数据处理

上述试验均重复3次，数据已均值±标准差表示，采用SPSS软件进行方差分析，差异显著性水平为P<0.05.采用Design Expert 8.0软件进行响应面设计.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 超声处理对SDF得率的影响

由图1可知，在50～150 W范围内，SDF得率与超声功率正相关，超过150 W后得率逐渐下降；在10～30 min范围内，SDF得率随超声时间延长而增加，随后得率迅速降低.超声波空化、机械及热效应随着其功率增加而增强，对细胞结构产生损伤作用，促进胞内物质(蛋白质、红枣淀粉等)的释放，有助于SDF的提取.但超声功率过大或者超声时间过长时，上述超声波效应会破坏SDF结构，引发其化学键断裂而降解为小分子物质，从而导致SDF得率降低[16].综合考虑最适超声功率和超声时间分别为100 W和30 min.

图1 超声功率及时间对红枣SDF得率影响

2.1.2 α-淀粉酶对SDF得率的影响

由图2可知，在100～200 U/g范围内，SDF得率与α-淀粉酶添加量正相关，超过200 u/g后得率逐渐下降.这可能是因为在一定α-淀粉酶添加量范围内红枣中淀粉逐渐得到充分酶解，SDF逐

渐分离完全，因而其得率逐渐增加至最大值，但继续加大α-淀粉酶添加量，酶活可能趋于饱和，高浓度酶也可能降解半纤维素等成分，因而SDF得率随之下降[17].在pH 4～6范围内，SDF得率随酶解pH升高而增加，此后得率逐渐降低.这可能是因为在一定范围内随着pH升高α-淀粉酶活性逐渐增强，但pH超过6后，α-淀粉酶活性中心催化基团中质子供体和受体的离子化以及必需基团的解离受到抑制，干扰酶与底物的结合，导致SDF得率下降[18].酶解温度在30 ℃～60 ℃范围内，SDF得率随酶解温度增加而增加，此后迅速下降.这可能是因为在一定范围内随着温度升高α-淀粉酶活性逐渐增强，但超过60 ℃后蛋白分子剧烈运动，破坏α-淀粉酶空间结构，该作用引发蛋白质聚集从而导致α-淀粉酶失活，因此SDF得率迅速下降[19].酶解时间在30～150 min期间SDF得率缓慢增加，这可能是因为随着α-淀粉酶酶解时间的逐渐延长，淀粉被分解，膳食纤维不断被分离出来，因而SDF得率逐渐增加.酶解时间继续延长导致酶解产物不断积累，从而抑制酶解反应，淀粉酶解率趋于稳定.综合考虑α-淀粉酶最适添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间分别为200 U/g、pH 6、60 ℃ 和 60 min.

图2 α-淀粉酶添加量、酶解温度、时间及pH对红枣SDF得率的影响

2.1.3 糖化酶对SDF得率的影响

由图3可知，在1 000～2 000 U/g范围内，SDF得率与糖化酶添加量正相关，超过2 000 U/g后得率逐渐下降.在pH 4～5范围内，SDF得率随酶解pH升高而增加，此后得率逐渐降低.酶解温度在30 ℃～50 ℃范围内，SDF得率随酶解温度增加而增加，此后迅速下降.酶解时间在30～60 min期间SDF得率缓慢增加，随后逐渐降低.对上述试验结果的分析与2.1.2“α-淀粉酶对SDF得率的影响”的分析相似.由于红枣含有一定量的淀粉类物质，因此去除淀粉类物质是提高红枣膳食纤维纯度的重要环节.采用α-淀粉酶和糖化酶顺序处理的目的是对红枣粉中淀粉以及α-淀粉酶水解产物(麦芽糖、糊精等)进行彻底水解，使其完全水解为葡萄糖，后续可通过简单水洗的方式将淀粉水解的葡萄糖去除，提高红枣膳食纤维纯度.综合考虑糖化酶最适添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间分别为2 000 U/g、pH 5、50 ℃和60 min.

图3 糖化酶添加量、酶解温度、时间及pH对红枣SDF得率的影响

2.1.4 木瓜蛋白酶对SDF得率的影响

由图4可知，在4 000～6 000 U/g范围内，SDF得率与糖化酶添加量正相关，超过6 000 U/g后得率逐渐下降.在pH 4～6范围内，SDF得率随酶解pH升高而增加，此后得率逐渐降低.酶解温度在30 ℃～60 ℃范围内，SDF得率随酶解温度增加而增加，此后迅速下降.酶解时间在30～60 min期间SDF得率大幅增加，随后随着酶解时间延长缓慢增加.对上述试验结果的分析与2.1.2“α-淀粉酶对SDF得率的影响”的分析相似.采用木瓜蛋白酶处理的目的是对红枣粉中蛋白质进行去除，提高红枣膳食纤维的纯度.木瓜蛋白酶在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质，具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，在红枣膳食纤维工业化提取中具有良好的应用前景[20].综合考虑木瓜蛋白酶最适添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间分别为6 000 U/g、pH 6、60 ℃和60 min.

图4 木瓜蛋白酶酶添加量、酶解温度、时间及pH对红枣SDF得率的影响

2.1.5 纤维素酶对SDF得率的影响

由图5可知，在400～1 200 U/g范围内，SDF得率与纤维素酶添加量正相关，超过1 200 U /g后得率逐渐下降.在pH 4～7范围内，随酶解pH升高，SDF得率上升，此后得率逐渐下降.酶解温度在40 ℃～60 ℃范围内，SDF得率随酶解温度增加而增加，此后迅速下降.酶解时间在30～60 min期间SDF得率大幅增加，随后随着酶解时间延长迅速降低.对上述试验结果的分析与2.1.2“α-淀粉酶对SDF得率的影响”的分析相似.虽然纤维素酶能够降解细胞壁，导致红枣胞内物质释放，有助于提高总膳食纤维得率.但本研究进行纤维素酶处理的主要目的是将部分IDF水解为SDF，提高SDF得率，SDF含量在TDF中占10%以上具有更好的保健功效.综合考虑纤维素酶最适添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间分别为1 200 U/g、pH 7、60 ℃和60 min.

图5 纤维素酶添加量、酶解温度、时间及pH对红枣SDF得率的影响

2.2 响应面优化

由于α-淀粉酶、糖化酶以及木瓜蛋白酶的主要作用是对红枣淀粉及蛋白类物质进行去除，提高红枣膳食纤维纯度.本研究主要关注红枣SDF得率，因此以SDF得率(Y)为响应值，主要考察纤维素酶添加量(A)、纤维素酶酶解pH(B)、纤维素酶酶解温度(C)以及超声功率(D)4个因素对SDF得率的影响，响应面试验方案及结果如表1所示.

表1 响应面试验设计和结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

由表2可知，响应面回归模型P<0.05，失拟项P>0.05，R2=0.88，说明该模型能够较好解析纤维素酶添加量、纤维素酶酶解时间、纤维素酶酶解温度、超声功率4因素对SDF得率的影响，可用于确定红枣SDF最佳提取工艺.

表2 回归方程参数方差分析表

续表2

2.2.2 最佳工艺参数及验证

采用Design Expert软件拟合出最佳工艺关键参数为：纤维素酶添加量1 307.78 U/g，酶解pH 6.9，酶解温度61.46 ℃，超声功率98.52 W，此条件下SDF得率为21.74%.考虑到实际操作，将上述工艺条件修改为纤维素酶添加量1 300 U/g，酶解pH 7.0，酶解温度60 ℃，超声功率100 W，此条件下3次重复试验的SDF得率为21.37±0.35%，与模型拟合理论值相近，说明响应面优化回归模型参数真实可靠.

2.3 理化性质分析

由表3可知，红枣SDF具有一定的持水性、持油性、膨胀力、阳离子交换等性质.由于膳食纤维中大量亲水基团与水分子结合，从而导致膳食纤维吸水膨胀，不但可促进人体肠道蠕动，防止便秘，而且有助于缓解泌尿系统压力，便于毒素快速排出.红枣膳食纤维具有持油性，表明其可在人体肠道中形成网状结构，吸附食物中油脂从而减少肠道对脂类物质的吸收，发挥减肥功效.SDF结构中的COOH-、OH-、NH2-等侧链基团可与有机阳离子进行可逆交换从而影响阳离子交换能力，该离子交换作用可改善人体消化道环境，减少消化道疾病风险[21].此外，红枣SDF具有较高的葡萄糖与胆固醇吸附率，具有预防高血脂、高血糖等疾病的生理活性[8].

表3 红枣SDF理化性质

2.4 结构表征分析

2.4.1 红外光谱测定

由图6可知，红枣SDF表现出与标准膳食纤维相似的红外光谱吸收图谱.红枣膳食纤维在874 cm-1、1 035 cm-1、1 630 cm-1、2 928 cm-1、3 435 cm-1附近的特征吸收峰可能与其结构中-C-O、-C-H、 -O-H的伸缩振动以及-C-H、-C-O的弯曲振动有关.3 435 cm-1处宽而圆润的吸收峰为-O-H伸缩振动峰，说明存在缔合态氢键，推测红枣膳食纤维具有半纤维素和纤维素成分；2 928 cm-1处吸收峰是糖环或其支链上-C-H伸缩振动峰，推测红枣膳食纤维中含有糖类物质；1 630 cm-1处吸收峰是-C-O的伸缩振动峰，可能与木质素芳香苯基团有关；1 035 cm-1处小峰是-C-O(C-O-C 键上)伸缩振动峰，属于典型的木聚糖吸收峰，推测红枣膳食纤维中可能含有木聚糖类成分.874 cm-1处小尖峰与-C-H(β吡喃环中)弯曲振动有关.上述吸收峰表明SDF具有典型的糖酯特征吸收峰，符合膳食纤维的结构特征[22-25].

图6 红枣SDF傅里叶变换红外光谱图

2.4.2 显微结构分析

如图7所示，红枣膳食纤维为形状不规则且具有空腔的块状结构，表面粗糙凹凸不平，颗粒大小不一.进一步放大观察到类似蜂巢的疏松多孔网状结构特征[8].该结构特征可使红枣膳食纤维比表面积增加，具有一定物理及化学吸附能力，因此红枣膳食纤维表现出良好的持水、持油、膨胀、离子交换、葡萄糖及胆固醇吸附等特性.

图7 红枣SDF扫描电镜图

2.5 抗氧化性分析

图8反映不同浓度红枣SDF分别对DPPH 和ABTS 自由基清除率的影响，以抗氧化剂VC为阳性对照.在1～7 mg/mL浓度范围，红枣SDF对DPPH和ABTS自由基清除率均随浓度的升高呈现显著上升趋势.红枣SDF浓度为7mg/mL时，DPPH和ABTS自由基清除率均达到90%以上.VC在1～7 mg/mL浓度范围内对DPPH和ABTS自由基清除率(>95%)明显高于红枣SDF，但其抗氧化性不具有剂量依赖性.上述结果表明，红枣SDF具有抗氧化性，但将红枣SDF添加到食品中是否可以延缓食品氧化并延长货架期，尚需后期在真实食品体系中进一步评估和验证.

图8 红枣SDF抗氧化活性

3 结论

通过响应面优化得到超声波-酶耦合提取陕北狗头红枣SDF的最佳工艺关键参数：纤维素酶添加量1 300 U/g，酶解pH 7.0，酶解温度60 ℃，超声功率100 W，此时，SDF得率为21.37±0.35%.提取的红枣SDF具有类似蜂巢的疏松多孔网状结构特征，推测含有糖类、木聚糖、半纤维素、纤维素、木质素等成分，并表现出一定的持水、持油、膨胀、阳离子交换及葡萄糖和胆固醇吸附特性，符合膳食纤维结构特征且理化品质良好.在1～7 mg/mL范围内，提取的红枣SDF抗氧化活性与其浓度正相关，DPPH和ABTS自由基清除率最高达到90%以上，具有一定抗氧化活性.研究结果为陕北狗头红枣膳食纤维制备和产业化应用提供了理论支撑，也为陕北狗头红枣高值化开发利用提供了参考.在后续研究中将对膳食纤维不同提取工艺对比，以期获得更高品质的膳食纤维.