黄皮33份种质资源花粉形态观察

刘友接，王建超，熊月明

(福建省农业科学院果树研究所，福州，350013)

花粉是植物系统发育中的保守器官，也是植物携带遗传信息的雄性生殖细胞，其形态特征受基因控制，受外界环境条件的影响较小，具有较强的遗传稳定性、可靠性和保守性[1-4]。种子植物的成熟花粉有其独特的形态特征，包括花粉大小、形状、萌发孔数量及位置、花粉表面纹饰等，这些稳定的保守性状可为植物系统分类、进化分析和物种起源提供依据[2-4]。运用扫描电镜观察花粉的形态特征并进行鉴定和系统分类在果树遗传学研究领域已得到广泛应用，如李[5]、杨梅[6]、榛[7]、番荔枝[8]、树莓[9]、火龙果[10]、荔枝[11]、橄榄[12]、桃[13-17]、枇杷[18-19]、苹果[20-21]、山杏[22]、樱桃[23]等。黄皮Clausenalansium(Lour.)Skeels是芸香科(Rutaceae)黄皮属的热带亚热带常绿小乔木，素有“果中之宝”的美称，是药食同源果树，原产于我国华南地区，至今有1 500多年栽培历史。福建省是我国黄皮主产区之一，其黄皮种质历经长期自然变异、人工选择育种和驯化栽培，种质资源十分丰富。目前，鲜见有关黄皮花粉超微形态特征观察研究报道。本试验以福建省不同黄皮产区的33份种质花粉为研究材料，运用扫描电镜研究其形态结构，以花粉性状数据为基础，采用聚类分析方法对33份种质进行分类，旨在为黄皮种质资源的系统分类鉴定提供孢粉学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020年4月，在福建省11个黄皮生产点选择农艺性状差异较大的33份黄皮种质资源，即晋安01，来自福建省农业科学院果树研究所；晋安02、晋安03、晋安04，来自福建省农业科学院果树研究所龙眼资源圃；晋安05、晋安06、晋安07、晋安08、晋安09，来自福建省农业科学院海峡现代农业示范园；云霄02、云霄03、云霄04、云霄05，来自福建省云霄县东厦镇竹塔村；芗城01，来自福建省漳州市芗城区琥珀小路2号；闽侯01、闽侯02、闽侯03、闽侯04、闽侯05、闽侯06，来自福建省闽侯县白沙镇大目埕村；罗源01、罗源02，来自福建省罗源县起步镇港头村；罗源03、罗源04、罗源05、罗源06、罗源07，来自福建省罗源县凤山镇城关村；福安01、福安02、福安03，来自福建省福安市穆阳镇苏堤村；福清01，来自福建省福清市音西街道芦院村；福清02、福清03，来自福建省福清市东张镇濑底村。

每份种质各选择长势良好的实生结果老树1株，在黄皮植株外围中上部健壮结果枝发育良好、花药饱满的花序上，选取含苞待放花蕾，掰开花瓣，采集花药，待花药开裂后收集花粉于指形管内，用5%戊二醛固定，5 ℃左右低温保存备用。

1.2 方法

花粉用5%戊二醛固定4 h，磷酸缓冲液清洗3次，每次间隔10～15 min；经1%锇酸固定4 h，用蒸馏水清洗3次，每次间隔10～15 min；用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐级脱水，每次间隔10～15 min，其中用100%乙醇置换3次；自然干燥；用离子溅射仪(型号：EIKO IB-5)进行喷金，让黄皮花粉表面镀上一层金膜；运用JSM-6380LV型扫描电子显微镜观察，分别选取代表性视野观察花粉群体形态特征(放大800倍)、单个花粉形态特征(放大3 500倍)、花粉赤道面中部的外壁表面纹饰特征(放大8 000倍)，并进行照相和记录。在Smile view软件下测量花粉表面网眼密度、极轴长、赤道轴长、萌发沟长度及宽度，计算极轴长/赤道轴长，每份资源测量花粉20粒。花粉形态特征描述主要参考王伏雄等[1]、王开发等[2]、G·埃尔特曼[4]的方法。

1.3 数据处理

运用SPSS 19.0软件的离差平方和法进行聚类分析，制作树状图。

2 结果与分析

2.1 花粉大小与形状

黄皮花粉为辐射对称型，花粉粒极轴平均长度为20.31 μm，赤道轴平均长度为18.09 μm，极轴长/赤道轴长(P/E)平均值为1.13。其中，福清02花粉极轴最大，为23.76 μm，晋安06最小，为17.97 μm；福清01花粉赤道轴最大，为20.55 μm，罗源03和罗源06最小，为17.11 μm；福清02的P/E最大，为1.23，晋安06的最小，为1.01。按G·埃尔特曼的分级标准[4]，黄皮花粉属于小的级别(直径10～25 μm)。花粉形状为近球形(0.88

2.2 萌发沟

萌发沟是花粉的重要形态特征。黄皮花粉具孔沟，33份种质绝大多数具有3条简单萌发沟和3个内孔，沟顺着极轴方向在赤道面上向两个极端辐射，并呈等间距环状分布，萌发沟相互间不交汇，有沟界极区，从极面观可观察到3条下凹的长形沟，赤道面观可观察到1～2条，根据G·艾特曼的分级标准[4]，黄皮花粉属于赤道三沟类型(N3P4C3)。长形沟，中段较宽，沟端渐尖，沟深浅不一，沟底膜上分布着数量不等、不规则形状的颗粒凸起，外壁在沟边缘不变薄。每条萌发沟均具有1个内孔，顶端被孔膜盖住，位于萌发沟中央，内孔较大，形状不一，纵长高出外壁，内孔与沟相交，沟中的3个内孔在赤道面上呈等距离的环状分布，孔的形状呈现多样性。其中，孔呈四方形的有闽侯01、闽侯02、闽侯05、闽侯06、福清01、福清03、云霄04、云霄05、福安01、福安02、福安03、晋安02、晋安08、晋安09、罗源01、罗源07、芗城01，孔呈近圆形的有罗源02、闽侯03、闽侯04、云霄03、晋安01，孔呈椭圆形的有罗源04、云霄02、晋安05，孔呈三角形的有晋安07，其余的均呈不规则形状。

不同种质萌发沟的长度、宽度及沟内凸起颗粒数量有差异。萌发沟平均沟长16.90 μm、平均沟宽2.98 μm；晋安03的萌发沟最长，为19.34 μm，芗城01最短，为14.84 μm；晋安02的萌发沟最宽，为3.92 μm，闽侯04最窄，为2.40 μm。不同种质花粉萌发沟内凸起颗粒多的种质有闽侯06、云霄04、晋安08、闽侯02、云霄02等，颗粒少的种质有罗源03、罗源05、罗源06、罗源07、闽侯03等。

2.3 花粉外壁纹饰

黄皮花粉外壁表面具有网状雕纹，由隆起的脊条相连接，组成多边形或不规则形状的网眼和脊洼，网脊宽窄不一，脊面较光滑，网眼大小不一，穿孔，呈漏空状，脊洼不穿孔，深浅不一。花粉表面平均网眼密度1.47个/μm2，福清01密度最大，为2.15个/μm2，晋安09密度最小，为0.95个/μm2。黄皮花粉表面纹饰复杂，不同种质花粉外壁纹饰因网眼密度、大小、穿孔多少、脊洼多少及深浅等形态变化不一，可大致分为3种类型：一类为网眼密度小，网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形状，较小，大小不一，密度小，穿孔少，脊洼多，较浅，如晋安09、晋安03等。二类为网眼密度中等，网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形状，较小，大小不一，密度中等，穿孔较多，脊洼较少，较浅，如晋安04、罗源07等。三类为网眼密度大，网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形状，孔较小，大小不一，密度大，穿孔多，脊洼少，较浅，如福清01、晋安06等(见表1、图1至图3)。

表1 33份黄皮种质花粉粒形态指标比较

图1 晋安01等11份黄皮种质花粉形态

图2 晋安07等11份黄皮种质花粉形态

图3 闽侯02等11份黄皮种质花粉形态

2.4 聚类分析

聚类分析结果看出，在等级结合线L1遗传距离为10处可将33份黄皮种质分为3类：第1类包括罗源03、罗源05、罗源06、罗源07、闽侯03、闽侯04、晋安02、晋安06、福安03、芗城01等10份种质，代表种质罗源05。基本形态特征是极轴、赤道轴均较短，均值分别为18.80、17.55 μm，花粉粒相对较小；极轴长/赤道轴长较小，为1.08；萌发沟最短，为16.29 μm，宽度中等，为2.92；表面网眼密度较大，为1.59个/μm2，外壁纹饰网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形，孔大，大小不一，穿孔多，脊洼少，较浅。

第2类包括闽侯01、闽侯02、闽侯06、福清03、云霄02、云霄04、福安01、福安02、晋安05、晋安07、晋安08、晋安09、罗源01、罗源02、罗源04等15份种质，代表种质闽侯01。基本形态特征是极轴、赤道轴长度中等，均值分别为20.44、17.85 μm，花粉粒大小中等，极轴长/赤道轴长较大，为1.15；萌发沟长度中等，为17.12，宽度最大，为3.10 μm；表面网眼密度最小，为1.40个/μm2，外壁纹饰网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形，较小，大小不一，穿孔较多，脊洼较多，较浅。

第3类包括云霄03、云霄05、闽侯05、晋安01、晋安03、晋安04、福清01、福清02等8份种质，代表种质晋安01。基本形态特征是极轴、赤道轴均较长，均值分别为21.98、19.21 μm，花粉粒较大；极轴长/赤道轴长较大，为1.15；萌发沟最长，为17.25 μm，宽度最窄，为2.83 μm；表面网眼密度中等，为1.44个/μm2，外壁纹饰网状，网脊隆起，宽窄不均，脊面较光滑，网眼为多边形或不规则形，孔较小，大小不一，穿孔多，脊洼少，浅。

在等级结合线L2遗传距离约15处可将33份种质分为2大类，其中第1类与第2类聚成一个类群，第3类聚成另一类群(见图4)，可见，第3类与第1类、第2类亲缘关系较远。说明黄皮花粉形态特征差异能够很好地反映种质间的亲缘关系。

图4 基于花粉粒性状的33份黄皮种质资源聚类分析

3 结论与讨论

运用扫描电镜对33份黄皮种质花粉的超微形态特征进行观察，结果表明，33份种质花粉的形态特征相对较一致，单粒，表面具有3条萌发沟和3个孔，沟顺着极轴方向延伸，从极面观可观察到3条，赤道面观可观察到1～2条，属于赤道3沟类型花粉；沟长形，沟底膜上分布着数量不等、不规则形状的颗粒凸起，外壁在沟边缘不变薄；孔位于沟的中央，顶端被孔膜盖住，孔较大，高出外壁，内孔与沟相交；花粉外壁表面具有网状雕纹，由隆起的脊条相连接，组成多边形或不规则形的网眼和脊洼。说明这些黄皮种质亲缘关系较近，符合植物传统分类学中种类同质性的论断。

不同黄皮种质的花粉大小，形状，萌发沟长度、宽度，凸起颗粒数量及外壁纹饰等超微形态特征上差异明显，形态特征多样性。花粉较大的种质有福清02、闽侯05等，花粉较小的种质有晋安06、罗源03、罗源06等；花粉近球形或长球形，极面观呈3裂圆三角形或3裂近圆形，赤道面观近圆形或椭圆形等，表面网状雕纹复杂等。这可能与黄皮种质资源来自不同产区的实生树、长期自然变异、种质分布区域、频繁异地引种活动及人工育种等诸多因素有关。孢子花粉外壁纹饰是细分孢粉属种的重要特征之一[2]，也有将花粉表面纹饰称作为品种(系)的“指纹”[24]。根据花粉表面网眼密度可大致分为网眼密度小、网眼密度中等、网眼密度大等3种类型。黄皮花粉外壁纹饰特征可为鉴别种质间的进化关系提供重要证据。花粉粒形态特征由内部基因控制，受外界条件影响较小，具有较强的遗传稳定性[1-2]。黄皮传统形态分类受外界生长环境影响较大，而花粉粒形态特征是在长期进化过程中不断演化和发展形成的，携带大量遗传演化信息，在黄皮种质鉴定和系统分类方面，孢粉学研究具有重要意义；但仅凭孢粉学鉴定不够全面，必须与果树形态学、遗传学、细胞学、分子生物学以及生物化学等研究结果结合起来，相互补充，全面分析，方可得出更为准确的结论。

花粉形态是每个果树种质独具的微观特征，可为种质亲缘关系分析、种质鉴定和系统分类提供依据[10]。本试验聚类分析结果表明，在遗传距离为10水平上，33份黄皮种质可分为3类，为黄皮种质资源间的亲缘关系研究提供了孢粉学证据。本研究仅从孢粉学方面对黄皮种质进行了分类，不同种质花粉形态特征与其植物学性状等方面的相关性尚待进一步研究。