防己诺林碱药理作用研究进展

王斐然，张会敏，林永强，张秋红

（1.山东中医药大学，山东 济南 250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014；3.山东省食品药品检验研究院，国家药监局胶类产品质量评价重点实验室，山东省中药标准创新与质量评价工程实验室，中药配方颗粒共性技术山东省工程研究中心，山东 济南 250101；4.济南市食品药品检验检测中心，山东 济南 250102）

防己是防己科植物粉防己（Stephania tetrandra S.Moore）的干燥根[1]。防己始载于《神农本草经》，具有祛风止痛，利水消肿的功效，用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒、癣疥疮肿、高血压等病症[2-3]。目前由防己分离的化学成分主要包括生物碱类、黄酮类、多糖、挥发油、甾体类等[4-6]，其中生物碱中的防己诺林碱是多种药理作用的重要活性物质之一。

防己诺林碱（fangchinoline，Fan）是从防己中分离得到的一种单体化合物（结构见图1），别名粉防己乙素、汉防己乙素、去甲基粉防己碱。现代药理学研究表明Fan有广泛的生物活性，如：抗氧化应激、抑制主动脉血管平滑肌细胞增殖、降血压、抑制组胺释放和抗肿瘤等活性[7-10]。本文通过查阅国内外文献，对Fan的药理作用进行综述。

图1 防己诺林碱的结构式

1 抗肿瘤作用

恶性肿瘤细胞具有分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征[11]。研究表明，Fan具有广谱抗肿瘤作用，主要通过抑制同源重组（HR）、AMP依赖的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/ UNC-51样激酶1通路（AMPK/mTOR/ULK1）、缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子/蛋白激酶B（HIF-1α/VEGF/Akt）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核转录因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路发挥抑制肿瘤细胞的细胞周期、减少肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡等作用。防己诺林碱抗肿瘤作用机制见表1。

表1 防己诺林碱抗肿瘤作用机制

1.1 抗结膜黑色素瘤的作用

Bao等[12]使用免疫缺陷的NCG小鼠皮下注射CM-AS16细胞，通过灌胃不同浓度Fan作为治疗组发现，Fan成剂量依赖性减小实体瘤的体积，且Fan治疗组小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酐和尿素水平与空白组无显著性差异，表明Fan对小鼠肝肾功能无损害；蛋白质印迹法（WB）和逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）实验结果表明，Fan可抑制肿瘤细胞中BRCA1、BRCA2、RAD50和RAD51基因的表达，并直接与FUBP2蛋白结合，抑制HR通路，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。

1.2 抗大肠癌的作用

Xiang等[13]采用体内外实验发现Fan可激活大肠癌细胞系HT26和HTC116中AMPK/mTOR/ULK1通路，自噬标志物 LC3-II和细胞自噬受体蛋白p62降解水平增加，促进自噬小体和点状结构形成，诱导细胞自噬，增加细胞凋亡；裸鼠皮下移植实体瘤进行体内验证发现，Fan可缩小大肠癌实体瘤的体积。望永鼎等[14]用Fan处理结肠癌细胞HT-29，48 h后发现克隆形成率显著降低，上皮细胞钙黏蛋白表达量上调，神经钙黏蛋白等表达显著下调，并经Fan治疗移植瘤后肿瘤体积缩小，且HIF-1α、VEGF和Akt的表达量下降，进一步验证了Fan通过抑制HIF-1α/VEGF/Akt信号通路对结肠癌产生治疗作用。Jiang等[15]发现Fan可阻断表皮生长因子受体（EGFR）的表达，通过抑制PI3K/Akt信号通路预防结肠癌，对人结肠腺癌DLD-1和LoVo细胞的细胞毒、细胞活性和增殖能力的作用呈剂量依赖性增长；用流式细胞仪发现Fan可诱导结肠腺癌Coad细胞凋亡和G1细胞周期阻滞，同时建立裸鼠异种移植瘤模型进行体内验证，结果表明，Fan有效抑制结肠腺癌细胞增殖、迁移、干化、侵袭和血管生成，诱导细胞凋亡。

1.3 抗白血病的作用

Xu等[16]发现粉防己碱和Fan的化学2D结构相似度可达到0.88，3D结构相似度可达到0.98，Fan对柔红霉素耐药的MOLT-4人急性T淋巴母细胞白血病细胞的P-糖蛋白具有显著抑制作用。Jung等[17]发现Fan可抑制人慢性髓原白血病细胞系KBM5和人多发性骨髓瘤细胞系U266的增殖生长；WB实验表明，Fan抑制IκB和p65的磷酸化，进而抑制NF-κB和AP-1两条通路的活化，阻滞KBM5和U266细胞生长，酶联免疫和DNA缺口末端标记法表明，Fan还能显著增强肿瘤坏死因子-α（TNF-α）活性，抑制细胞增殖，裂解DNA修复酶，诱导细胞凋亡。

1.4 抗非小细胞肺癌的作用

陈澜涛等[18]通过检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3）、Caspase 8和Caspase 9等表达发现，Fan随浓度升高可逐渐提高肺癌H1299和A549细胞中细胞DNA内切酶活性，且降低细胞中凋亡相关蛋白（MCL-1、Bax和p53）和转移相关蛋白[基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）]的表达，RT-PCR检测表明，细胞中MAPK信号通路的p-Akt、PI3K、mTOR表达被抑制，进而阻滞H1299和A549细胞停留在G0/G1期，促进细胞凋亡。

Luo等[19]采用吉姆萨染色和流式细胞术技术发现，Fan使人肺癌SPC-A-1细胞活性减弱；WB和PCR结果表明，Fan阻滞Cyclin D1表达，下调肿瘤细胞内细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）、CDK6和Cyclin D1蛋白的水平，显著降低细胞周期关键基因（Cyclin D1、CDK4和CDK6）的mRNA表达水平，抑制E2F转录因子-1活性，明显阻滞SPC-A-1肺癌细胞的增殖。

1.5 抗乳腺癌的作用

Wang等[20]发现Fan呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，经Fan治疗细胞内MMP-2和MMP-9含量下降。WB检测结果表明 Fan使MDA-MB-231内NF-κβ蛋白表达降低，Iκβ蛋白表达水平升高，同时下调PI3K/AKT/mTOR信号转导通路，诱导细胞凋亡。张艳辉等[21]发现Fan可有效减小三阴乳腺癌实体瘤的体积，并利用噻唑蓝比色法计算出Fan对三阴性乳腺癌细胞BT549的IC50为8.99 μmol/L，BT549细胞的Smo、Gli1蛋白表达水平明显降低，通过抑制Hedgehog通路促进肿瘤细胞凋亡，且细胞的凋亡程度与Fan的浓度呈正相关。

1.6 抗其他肿瘤的作用

研究表明，Fan还可治疗其他肿瘤疾病。Fan作用于膀胱癌细胞株T24和5637后可降低细胞内ATP水平；细胞中增殖细胞核抗原表达下调，LC3-II/LC3-I比值上调，p62水平下调，通过抑制肿瘤细胞的mTOR通路，促进膀胱癌细胞株的凋亡，诱导膀胱癌细胞发生自噬[22]。此外，Fan对于胰腺癌也有治疗作用，Lee等[23]发现Fan可通过清除细胞内的活性氧（ROS）抑制胰腺癌细胞MiaPaCa-2和PANC-1的增殖；且Fan是一种天然的孤儿核受体核受体亚家族4组A成员1 （NR4A1）抗剂，可通过抑制MiaPaCa-2和PANC-1细胞中Sp1蛋白依赖的反式应激拮抗NR4A1的表达，促进胰腺癌细胞凋亡。Li等[24]发现Fan可以明显降低骨肉瘤MG63和U20S细胞中Aktp-Thr308表达，细胞周期阻滞；此外，还可下调MG63细胞PI3K通路及下游的Cyclin D1和MMP-2和MMP-9表达，上调caspase-3和caspase-8蛋白表达，呈剂量依赖性抑制MG63和U20S细胞增殖，降低MG63细胞的迁移和侵袭能力，促进人骨肉瘤细胞的凋亡。王迅等[25]使用不同浓度的Fan处理人胶质母细胞瘤U251 细胞，通过划痕实验检测发现Fan 呈剂量依赖性抑制 U251 细胞的迁移能力，且12，24及48 h后Fan均可有效抑制细胞活力；在分子机制研究中，Fan处理后U251 细胞中 Akt 蛋白质磷酸化水平降低，抑制Akt通路，阻滞细胞生长，促进U251的凋亡。

2 抗骨质疏松作用

周琳等[26]利用Fan治疗去除卵巢诱导的骨质疏松小鼠模型，结果表明，抗酒石酸酸性磷酸酶、I型胶原羧基末端肽及I型胶原氨基末端肽表达显著下降，通过Micro-CT评估实验组小鼠骨组织微结构相关指标（骨小梁百分比、骨小梁数量和骨小梁厚度）显著升高，骨小梁分离度显著降低，检测发现Fan治疗小鼠骨质疏松骨吸收相关基因（抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、活化T细胞核因子1和降钙素受体）表达显著下降，表明Fan对去卵巢小鼠骨质疏松有保护作用。Zhou等[27]利用新鲜分离的C57BL/6小鼠骨髓巨噬细胞发现Fan可减弱骨髓巨噬细胞NF-κB受体诱导的信号转导，下调骨质疏松小鼠T细胞核因子1的活性和表达而不影响IκBα降解和丝裂原活化蛋白激酶通路，Micro-CT分析发现股骨的骨小梁百分比、骨小梁数量和骨小梁厚度呈剂量依赖性增加，骨小梁分离度降低，表明Fan对骨质疏松的骨组织有保护作用。徐志平等[28]对大鼠骨质疏松模型腹腔注射不同剂量浓度Fan 1个月，检测发现Fan呈剂量依赖性提升自噬相关基因（ATG）的表达，例如显著增强了ATG-5、转录因子2、Beclin-1和骨形态蛋白2的表达，并显著降低股骨组织中NF-κB受体活化因子配体表达，表明Fan是通过增加自噬实现预防骨质疏松大鼠骨质流失。

3 抗炎作用

炎症反应是人体对外界刺激的一种防御反应，表现为红肿热痛，大多数炎症反应对人体有益，但失调的炎症反应会对机体产生损伤，如糖尿病肾病、风湿性关节炎和神经细胞炎症等。

Chen等[29]实验表明，Fan能显著减少急性心功能不全大鼠模型的单核细胞趋化蛋白-1、TNF-α、白细胞介素（IL-1β）、IL-18和IL-6等炎性细胞因子释放；此外，Fan处理后提高了超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛的含量，同时显著抑制p65、细胞外调节蛋白激酶1/2和NF-κB的磷酸化，进而抑制内毒素应激大鼠心肌细胞的凋亡，减轻心肌损伤。

Jiang等[30]用高脂饲料喂养大鼠4周，单次腹腔注射链脲霉素（30 mg/kg）诱导糖尿病肾病，实验组每日1次口服Fan进行治疗，大鼠血清中IL-6和TNF-α水平明显降低，Fan可抑制MMP-9、环氧化酶2和TNF-α表达，降低异常表达的p38-MAPK；对大鼠肾脏进行组织切片染色发现Fan可减轻氧化应激和炎症造成的肾脏损伤，发挥肾脏保护作用。

Villa等[31]用不同浓度的Fan处理人成纤维样滑膜细胞（FLS）1 h后给予IL-1β（10 ng/ml）刺激，Fan处理后细胞活性无变化，但ROS测定和WB分析表明，Fan可减少产生人FLS细胞炎性细胞因子和ROS，减少人FLS细胞MAPK通路和NF-κB通路磷酸化；角叉菜胶/高岭土关节炎大鼠模型用组织病理学技术和苏木精-伊红染色对大鼠左膝关节进行处理，与未经治疗的关节炎组相比，治疗组大鼠的炎症评分均明显降低，在组织学照片中表现得尤为明显，表明Fan可改善炎症关节红肿热痛的症状，改善炎症体征，抑制关节炎小鼠膝关节软骨降解。Shan等[32]使用Fan连续治疗类风湿性关节炎模型大鼠21 d后，血清中异常表达的脂质过氧化物、谷胱甘肽、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶恢复到接近正常水平；Fan组TNF-α、IL-6、MMP-3和前列腺素E2水平下降，NO、尿酸、铜蓝蛋白和铜的含量降低，但锌含量增加，风湿性关节炎的炎症反应降低。

Bao等[33]利用谷氨酸诱导神经元HT22细胞氧化性损伤，向其中加入核因子E2相关因子2（Nrf2）抑制剂Brusatol（80 nmol/L）2 h后加入Fan，噻唑蓝比色法法检测表明，Fan成剂量依赖性阻止HT22细胞死亡，显著减轻细胞内ROS过量产生，逆转谷氨酸引起的SOD活性下降，RT-PCR发现Fan有效上调HT22细胞中异常下降的Nrf2和血红素加氧酶的水平，siRNA瞬时转染表明Fan可在mRNA水平和蛋白质水平下调Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1的表达，抑制谷氨酸氧化产生的神经毒性。

Han等[34]对新生大鼠右侧颈总动脉结扎建造脑缺血模型，连续3 d腹腔注射Fan进行治疗后发现，Fan可降低缺血动物模型后脑组织异常升高的IL-1β和TNF-α；组织病理学研究表明，与缺血空白模型相比，Fan组大鼠脑组织髓鞘碱性蛋白含量明显升高，脑损伤百分率明显降低；此外，Fan治疗组大鼠脑组织中诱导型一氧化氮合酶、VEGF、p53和Nrf2的表达减弱，改善新生大鼠脑缺血后神经元变性中血管生成分子的表达，以此善新生大鼠脑缺血诱导的神经元损伤。

4 药物的其他药理作用

4.1 抗病毒的作用

Kim等[35]利用HCoV-OC43病毒感染MRC-5人肺细胞后给予Fan进行治疗，Fan在感染的MRC-5人胚肺细胞早期可抑制病毒S和N蛋白的表达，并降低感染细胞中IL-1β、IL-6和IL-8的表达，阻滞HCoV-OC43病毒的复制，使MRC-5细胞存活率显著上升，且治疗作用呈剂量和时间依赖性。Wan等[36]利用HIV-1cDNA转染人胚肾细胞系HEK293T后给予Fan进行治疗，Fan能抑制HIV包膜蛋白HIV-1糖蛋白160的加工，导致包膜糖蛋白进入新生病毒粒子减少，进而抑制感染性病毒粒子产生，主要作用于HIV感染晚期阶段。

4.2 抗糖尿病视网膜病变的作用

Wu等[37]通过腹腔注射链脲佐菌诱导大鼠产生糖尿病视网膜病变模型，研究发现Fan可使异常表达的晚期糖基化终产物、血浆糖化血红蛋白和血糖浓度明显下降，减轻视网膜组织匀浆中氧化应激指标及炎症细胞因子（VEGF、TNF-α、IL-1b、IL-6）的表达，抑制晚期糖基化终产物基因表达，视网膜组织中NF-κB表达下降，细胞凋亡指数有效降低，减轻糖尿病后期诱发的视网膜形态改变。

4.3 抑制瘢痕生长的作用

宋英莉等[38]利用原代瘢痕组织成纤维细胞进行实验发现，Fan可呈剂量依赖性地抑制瘢痕组织成纤维细胞的增殖能力，抑制Cyclin D1和B淋巴细胞瘤-2基因在瘢痕组织成纤维细胞中的表达，对正常成纤维细胞的增殖无影响，表明Fan只对增生性瘢痕有抑制作用。

4.4 与肿瘤靶向药物的协同作用

Fan与3-甲基腺嘌呤联合用药时，大肠癌HT29和HCT116细胞的存活率均显著降低，同时对正常细胞无伤害，表明在Fan诱导细胞凋亡时3-甲基腺嘌呤可对正常细胞产生保护作用[13]。Kong等[39]研究表明，Fan-黄连碱/小檗碱对乙酰胆碱酯酶有协同抑制作用。何丽等[40]对耐药卵巢癌细胞株SKOV3/ADM进行了Fan与紫杉醇的联合用药实验，结果表明，Fan可促进紫杉醇的摄取率，逆转癌细胞对紫杉醇长期用药产生的耐药性。Fan也可显著提高吉西他滨对黑色素瘤细胞A375细胞株的促凋亡作用，还可提高结膜黑色素瘤CM-AS16细胞对顺铂、阿霉素的敏感性[12]。

5 总结与展望

Fan是从防己中提取分离得到的一种天然活性成分，对肿瘤、骨质疏松、炎症、病毒感染、糖尿病诱导的视网膜病变等多种疾病均有治疗作用。近年对于Fan的药理研究已深入到细胞分子水平，可更加准确地阐述Fan的药理作用机制。随着研究深入，Fan针对不同疾病作用机制逐渐明确，通常是多种通路交互作用，可为未来的深入研究和疾病治疗提供参考，但由于Fan属于难溶性物质，口服生物利用度较低，限制了其临床应用。随着未来基因工程、代谢工程及分子生物学等现代科学技术发展，Fan类药物极有可能开发出应用于临床的成药。